常见鼠药中毒及检测技术研究进展

杨 玲，李红芳，白宇琛，句荣辉，于雪芝，余文博，温 凯，沈建忠，王战辉*

(1.中国农业大学 动物医学院 动物源食品安全北京市实验室，北京 100193；2.北京农业职业学院，北京 102442)

啮齿类动物不但会对农业生产造成危害，导致经济损失，还会携带多种疾病，传播给人类及动物[1-2]。目前，使用鼠药是最经济有效的控制啮齿类动物的方式。鼠药是一类对啮齿类动物具有毒杀作用的化合物，国内外鼠药种类繁多，常见的鼠药有20多种[3-4]。大多数鼠药对人畜均具有较强毒性，由于使用或管理不当，近年来由误食、二次中毒、自杀及恶意投毒等原因导致的中毒事件常有发生，对人类及非靶标动物的生命健康产生了严重威胁，同时造成了严重经济损失和恶劣社会影响。不同鼠药的毒性、潜伏期、中毒症状以及病理特征等各异，易与一些内科疾病混淆，因此建立鼠药中毒临床前检测方法特别是快速检测方法，是确定治疗方案和抢救措施中十分关键的一环，可为鼠药中毒临床抢救和治疗赢得宝贵时间，为治疗处理提供指导信息。

1 鼠药分类

鼠药种类繁多，根据药物性质可分为抗凝血剂类、致痉挛剂类、维生素D类、无机化合物类、有机磷类、有机氯类、代谢毒物类及其他杀鼠剂[4-5](表1)。其中，士的宁在19世纪末和20世纪初应用较多，1988年美国颁布了禁令以保护非靶标物种。但于2009年又将士的宁归类为限制使用产品[6-7]；溴鼠胺属于代谢毒物类杀鼠剂，经美国环保局认定可用作灭鼠剂[8]；有机氯、有机磷类杀鼠剂虽然初次灭鼠效果好，但是连续使用会致使鼠拒食，降低灭鼠效果[9-10]；维生素D类鼠药安全性较高，是唯一可施用于食品加工场所的一类杀鼠剂，但灭鼠时需要较大药物剂量，导致灭鼠效率较低[11-14]；鼠特灵、灭鼠优、红海葱苷、α-萘硫脲等杀鼠剂现已较少使用或已停止使用[15]。致痉挛剂类的鼠立死、杀鼠硅、毒鼠强(Tetramethylenedisulfotetramine，TETS)，代谢毒物类鼠药氟乙酰胺(Fluoroacetamide，FAM)和氟乙酸钠，有机氯类鼠药异狄氏剂均为剧毒性药物，全球各国已明令禁止使用[16-18]。由于FAM和TETS毒性强、杀鼠效果好、合成简单等特点，当前仍存在违法使用现象，由此导致的自杀及恶意投毒事件时有发生。抗凝血剂类鼠药(Anticoagulant rodenticides，ARs)与其他鼠药相比，毒性低、灭鼠效果好，是目前应用最为广泛的一类杀鼠剂，根据其结构可分为两类：香豆素类和茚满二酮类[19]。基于TETS和FAM造成中毒的社会危害性及ARs广泛使用性，本文重点针对FAM、TETS和ARs进行了论述。

表1 鼠药的分类[4]Table 1 Categories of rodenticides[4]

2 常见鼠药中毒概况

据报道，我国每年发生急性鼠药中毒达50 000～70 000人，死亡率为各种传染病的66.7倍[9,11]。如1996～2005年间，仅江西景德镇由鼠药导致的中毒人数为772人[20]。何婧等[21]调查了439例鼠药中毒患者的中毒流行病学特点，其中误服和自服患者占比分别为20.72%、79.27%。常见鼠药中毒概况汇总如下：

2.1 氟乙酰胺(FAM)中毒概况

FAM是我国禁止使用的神经性、剧毒杀鼠剂，具有毒性强、发病快、无特效解毒药等特点，口服半数致死量(LD50)为2～10 mg/kg，酸性环境下水解为氟乙酸，在碱性环境下水解为氟乙酸钠。FAM可通过皮肤、呼吸道和消化道进入体内，影响三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)的生成以及中间产物的代谢过程。FAM阻止三羧酸循环的过程可引起高活性氧自由基的激增，ATP生成量减少，细胞膜结构松散，电子结构不稳定，极容易被氧自由基夺去电子，生成的氟乙酸和氟柠檬酸可造成心、脑、肺和肝等的损伤，若不及时抢救会引发死亡[1]。FAM虽然已经被禁止生产、销售和使用，但由于监管力度不强,加之FAM毒性强、杀鼠效果好、合成简单等特点，目前市场上仍有以FAM为主要成分的灭鼠药销售。由FAM导致的中毒案例国内外均有报道，如1995～2019年，中国有3 000多起中毒事件与FAM有关；1963年斯马尔登事件、威尔士的梅瑟蒂德菲尔等中毒事件[22]。FAM造成的食物中毒、自杀和投毒事件层出不穷，表2列举了国内外的FAM重大中毒事件。

表2 FAM重大中毒事件[1]Table 2 Major poisoning cases of FAM[1]

2.2 毒鼠强(TETS)中毒概况

TETS具有神经毒性，其毒性为氰化钾的100倍，且无有效解毒药。TETS不仅对啮齿类动物有毒，而且会导致人类中毒[23]。TETS的急性毒性(LD50)为0.1～0.3 mg/kg体重，其中毒的轻微症状表现为头痛、头晕和疲劳，严重的临床特征包括意识减退、癫痫发作、尿失禁、昏迷和呼吸衰竭死亡，α2β3γ2被证明是最重要的γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体，由GABAA受体阻断引起的癫痫发作可持续数年[1]。由于TETS剧烈的毒性和稳定性，易造成二次中毒。每年在美国有数十起中毒事件，但在中国发生的中毒人数最多[24]。据报道，全国每年因TETS等剧毒鼠药导致的中毒人数约为7万人，仅2002年利用TETS等剧毒鼠药投毒作案51起，占全国重特大投毒案件69%。1991～2010年仅在中国就发生了14 000多例TETS中毒事件，其中932例死亡[25]。我国近20年发生的TETS中毒事件如表3。

表3 毒鼠强重大中毒事件[1]Table 3 Major poisoning cases of TETS[1]

2.3 抗凝血鼠药(ARs)中毒概况

与其他鼠药相比，ARs相对毒性低、灭鼠效果好，是使用范围最广的一类杀鼠剂[19]。ARs在结构上类似于维生素K，可以竞争性抑制维生素K循环，使得维生素K无法生成Vitamin K1H2，阻断维生素K循环。而一旦维生素K循环中断后则无法产生活性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，导致机体出现凝血功能系统障碍，凝血时间延长，造成毛细血管破裂、皮下出血、牙龈出血、内脏出血等症状，严重者甚至死亡[2]。唐玲玲[26]对49例儿童ARs中毒事件进行了统计分析，发现儿童中毒病例逐年上升，这可能与香豆素类杀鼠药普遍使用以及监管力度缺乏有关。四川大学华西医院在2008～2016年间共诊断并治疗了65名抗凝血剂类鼠药中毒儿童[7]。Yan等[27]报道的2011～2013年间上海117例鼠药中毒患者中，主要中毒人群为0～9岁儿童。分析中毒原因可能是由于ARs多为色彩鲜艳的固体拌料，比较吸引儿童注意，从而导致儿童误服[28]。另外，据美国国家毒物控制中心统计，1987～2018年间，平均每年由ARs导致的中毒人数约为11 021人，1987～2002年凝血类鼠药中毒人数逐渐增加并达到最高值，2002～2018年中毒人数持续下降[29-36](图1)。其中，误服鼠药中毒患者占比约为95%，服毒自杀患者约占2%～4%。按照年龄分布统计，5岁以下儿童中毒所占比例较高(88%)，成年人中毒所占比例较低(9%)。

图1 1987～2018年凝血类鼠药中毒统计Fig.1 Annual reported exposures of ARs from 1987 to 2018

3 鼠药常用检测方法

目前鼠药的检测方法主要有化学显色法，基于仪器的分析方法(如液相色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法、离子色谱法)，以及基于抗原抗体的免疫分析方法等。

3.1 化学显色法

王大力等[37]基于奈氏试剂法、异羟肟酸铁反应法和氯-碘化钾淀粉法对FAM进行快速检测。FAM与奈氏试剂作用生成黄棕色沉淀，阳性率为51.57%；FAM与羟胺在碱性环境下与三价铁离子作用生成紫红色异羟肟酸络合物，阳性率为29.27%；FAM与碘化钾淀粉作用，遇氯后使碘游离而将淀粉变蓝，阳性率为31.71%。张洪歌[38]系统比较了市场上常见的FAM快速检测产品，优化了提取方法。果蔬食材样品为2 g时，使用4 mL水作为提取溶剂，通过含有0.5 g活性炭的过滤柱过滤后，回收率较好。对FAM添加浓度为50.0和100.0 μg/g的果蔬食材进行检测时，发现4种FAM快检产品的灵敏度高(达100%)、准确性好(94%以上)、适用性强。同时也对TETS快速检测产品进行了比较。化学显色法检测TETS常用的是变色酸法和盐酸苯肼法，TETS经乙酸乙酯提取，活性炭过滤后对食材检测有较好的回收率和色素吸附效果，添加5.0和10.0 μg/g的TETS果蔬食材检测时发现，10种快检产品中有3种TETS快检产品灵敏度高(均达到100%)、准确性好(准确度在95%以上)、适用性强。郑晓娟[39]将TETS用有机溶剂提取、纯化后，用分解剂分解，其两个分解产物二甲磺胺和甲醛在一定条件下与显色剂变色酸和纳氏试剂作用后呈显色反应，可检测其是否存在。

3.2 仪器分析方法

3.2.1 液相色谱(液相色谱-质谱)法孟庆玉等[40]建立了同时测定食物中毒样本中敌鼠钠盐、杀鼠醚和杀鼠灵的高效液相色谱法，以乙腈-乙酸铵(57∶43，体积比)为流动相，样品经C18柱分离后，DAD二极管阵列检测器进行检测，得到固体样本的检出限(Limit of detection,LOD)为0.015 μg/g，液体样本的LOD为0.003 μg/mL，平均加标回收率为85%～109.2%。Guan等[41]采用HPLC-MS/MS法测定血液和尿液中华法令、杀鼠醚、敌鼠(Diphacinone，DPN)、氯敌鼠和溴敌隆的含量，此方法采用大气压化学电离，测得血液和尿液的检出限分别为5 ng/mL和2.5 ng/mL。Imran等[42]采用不同萃取方法对不同样品进行前处理，在荧光或紫外两种检测器模式下，使用HPLC-MS/MS法对血浆、血清、尿液、肝脏和食物等样本中的抗凝血类鼠药进行了定量分析。王怡君等[43]为应对临床中毒快检的需求，建立了干血斑样本中12种抗凝血鼠药的液相色谱-串联质谱分析方法。沈卫东等[44]建立了HPLC-MS/MS方法同时对FAM和氟乙酸钠进行检测，此方法快速、灵敏且不需要衍生化，FAM的LOD仅为10 μg/L，线性范围为10～500 μg/L，氟乙酸钠的线性范围为10～500 μg/L，相关系数(R2)均可达到0.999 9，适用于痕量有毒物质的定性和定量检测。Owens等[45]建立的HPLC-MS可用于测定饮料(包括牛奶、果汁、茶、可乐和水)中掺入的TETS。

3.2.2 气相色谱(气相色谱-质谱)法Bullard等[46]采用GC测定样品中DPN和氯敌鼠的残留，测定前将DPN氧化转变成苯甲酮，用电子捕获器检测，血液样品中检测下限为10 ng/mL，奶样为0.5 ng/mL。陈坚等[47]采用GC-MS对血清中DPN进行测定，测定流程为乙酸乙酯-乙醇(2∶1，体积比)对样本进行萃取，HP-5MS交联弹性毛细管石英柱进行分离，氦气为载气进行质谱分析，药物浓度在0～2.5 mg/L范围内的线性关系良好，LOD为4×10-4mg/L。目前，仅河北省和司法部司法鉴定科学技术研究所建立了关于鼠药中毒样品、血液和尿液中FAM、TETS测定的气相色谱法(DB 13/T 444-2000；SF/Z JD0107003-2010)。Wu等[48]采用GC测定了TETS，测得平均回收率为89.8%，LOD为1.00 ng/mL。马永建等[49]报道了GC-MS对中毒样品中FAM的鉴定，利用FAM的特征离子峰m/z77、44进行定性和定量测定，建立的FAM检测方法的线性范围5～40 g/mL，LOD为2 g/mL，样品加标回收率为52.25%～94.30%。封雷等[50]用GC/FID测定食品及生物材料中FAM，其LOD为12.5 g/mL，RSD为6.5%～7.9%，回收率为72%～85%。陈国雄等[51]应用升温毛细管气质联用法建立了快速检测TETS和FAM的分析方法，二氯甲烷萃取后回收率为62.3%，采用气相色谱氮磷检测器法对食品和组织中的TETS进行检测，其LOD为0.02 ng/mL[52]。Zeng等[53]还建立了气相色谱/火焰热离子检测器结合直接浸入式固相微萃取(DI-SPME)测定人尿中TETS的分析方法，TETS的定量限为0.082 μg/mL。

3.2.3 紫外分光光度法谷日旭等[54]应用紫外分光光度法测定中毒样品中DPN含量，通过紫外吸收光谱法进行定性分析，确定为阳性后再用双波长紫外分光光度法进行定量分析，测得小米汤样和小麦面粉样的加标回收率分别为94.6%和93.3%，RSD分别为3.8%和4.7%。紫外分光光度法具有操作简单、分析速度快等特点，但DPN在286 nm处的紫外吸收很大，不同样品在此处也有不同程度的本底吸收，因此容易出现假阳性和测定结果偏高的现象。王群等[55]在硫靛法检验FAM传统方法的基础上，使用紫外可见分光光度计基于硫靛反应检验FAM，灵敏度为2 μg/mL，较传统硫靛法提高了10倍。

3.2.4 离子色谱法沈平等[56]将FAM与热的氢氧化钠反应生成易离解的氟乙酸盐，采用离子色谱法分析FAM，其线性范围为0.1～10 mg/L，回归系数(r)为0.999 6，方法的回收率为90.1%～98.2%，日内相对标准偏差为0.94%～2.53%。王燕军等[57]建立了离子色谱法检验生物检材中的FAM，分析结果表明生物检材中FAM的回收率大于90%，氟乙酸钠和氟离子的线性范围分别为20～500 ng/g和1 ng/g～1 μg/g，检出限分别为10 ng/g和1 ng/g，相对标准偏差均小于1%。采用离子色谱法能减少衍生化步骤，实现对样品中FAM的直接检测，但灵敏度不如液相色谱法和气相色谱法。

上述仪器分析方法是测定样本中鼠药化合物的常用方法，具有准确度和灵敏度高的优点，但仪器设备操作复杂、检测耗时长、样本前处理复杂，不适合大批量样本的快速筛查。

3.3 免疫分析法

仪器检测技术虽然灵敏，但不具有快速和高通量的特征。免疫层析技术具有操作简单、耗时短、不依赖大型仪器等优点。基于抗原-抗体特异性相互作用的免疫分析方法具有快速、易用、成本低等优点，在毒物临床诊断中具有广阔的应用前景，是一种快速筛选食品中有害化合物的主流技术[58]。免疫检测技术主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)[59]和侧流层析免疫分析法(LFIA)[60]等，已在分析化学领域得到广泛应用。但关于用免疫分析法测定样本中FAM、TETS和ARs的研究较少，且均为传统的ELISA和LFIA。

LFIA是一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速检测技术，具有操作简单、耗时短、不依赖大型仪器的优点。金纳米颗粒(AuNPs)是LFIA最常用的信号探针，目前基于新型标记探针的LFIA可有效地提高检测灵敏度[61]。Li等[2,62]开发了一种通用型半抗原的设计策略，合成了ARs半抗原，制备出可识别12种ARs的广谱识别性抗体。以量子点微球为信号探针开发了快速、灵敏、准确、可靠的荧光LFIA，该方法可用于人血清、尿液及食物样本中8种ARs的定量与定性测定。与常规ELISA相比，检出限显著降低(10倍)，并与UPLC-MS/MS的相关性良好，在临床检测中具有良好的应用前景。华法林(WAR)除了用作杀鼠剂，还可以用作人口服抗凝药物。有研究建立了检测血液中WAR(人口服抗凝药物)的免疫分析方法，并将其用于WAR药物的浓度监控。如Dorman等[63]基于胶体金的检测试纸条建立了可特异性测定犬血清中WAR的分析方法，Cut-off值为9.9 μg/L。Satoh等[64]将醋硝香豆素的硝基还原为氨基作为半抗原，制备抗WAR抗体，建立了放射性免疫分析法，该方法的半数抑制浓度(IC50)为10 ng/mL。O'Kennedy等[65-66]用同样的方法合成WAR半抗原并制备了抗WAR抗体，建立了基于抗体的表面等离振子共振方法测定血浆中WAR，方法的线性范围为4～250 ng/mL。

酶联免疫技术是基于抗原-抗体特异性反应及酶的高效催化作用构建的快速检测技术，具有灵敏度高、准确度好的优点。随着基因工程技术及纳米科技的快速发展，基于荧光、化学发光信号等的高灵敏度的ELISA被开发并用于食品中有害化合物的快速检测。Marco等[67]以WAR和醋硝香豆素为原料，采用羧甲基羟胺法和硝基还原法合成3种WAR半抗原，基于混合酸酐法合成完全抗原，制备抗WAR多克隆抗体，建立了ELISA检测血浆样本中WAR的方法，LOD为0.48 μg/L，线性范围为1.65～41.8 μg/L。Jackson、Li等[68-69]分别采用羧甲基羟胺法合成DPN半抗原，制备抗DPN特异性抗体，其中，Jackson建立的ELISA在缓冲液中的线性范围为10～320 μg/L，Li等建立的icELISA方法对血浆、尿液和肝脏中DPN的LOD分别为0.28 μg/L、0.32 μg/L、0.55 μg/kg。Yang等[1,70]首次成功地合成了FAM半抗原并制备了5株mAb 1B6、2C11、3F1、4E10和5D11，其中mAb 5D11与异源包被原FAM1-BSA配对时识别FAM，IC50值为97 μg/mL，且与其他9种功能和结构类似物无明显的交叉反应，所获得的mAb 5D11抗体有望作为FAM中毒的快速诊断试剂和临床治疗的解毒药。另外还建立了FAM的胶体金免疫层析分析方法，Cut-off值为500 μg/mL；建立了TETS的ELISA法，LOD为0.1 ng/mL。免疫层析法操作便捷，有望用于中毒患者的现场快速检测，以及用于指导患者后续的治疗工作，还有望成为有效的解毒药。

4 展 望

针对鼠药，科研人员已经开发出大量实验室检测技术和现场快速检测技术，这些检测技术各具优势，但也存在不足，概括为：(1)仪器分析方法是测定样本中鼠药的常用方法，具有准确度高、灵敏度高的优点，可用于快速筛查结果的进一步确证，但仪器设备操作复杂、检测耗时长、样本前处理复杂，不适合样本的快速筛查。(2)基于抗原-抗体特异性相互作用的免疫分析方法具有快速、易用、成本低等优点，在毒物临床诊断中具有广阔的应用前景。(3)有些鼠药具有特效解毒药，但有些鼠药则没有。免疫分析法不仅可作为一种快速检测手段，其所采用的抗体还可能成为一种有效的解毒药。