盐渍辣椒真菌多样性分析

2021-05-15赵玲艳黄嘉欣卿煜维潘金微邓放明

中国食品学报 2021年4期

赵玲艳，黄嘉欣，杨剑，卿煜维，潘金微，黄洁，邓放明

（湖南农业大学食品科学技术学院长沙410128）

盐渍辣椒制作过程中常添加15%以上的食盐，0.05%～0.1%的CaCl2及0.05‰～0.1‰的焦亚硫酸钠，因此该类辣椒保藏时间较长，且能保持较脆的辣椒口感，是剁辣椒加工过程中一类原料[1-3]。盐渍辣椒的质量好坏，直接影响中、低盐再加工品的质量和安全。近年来，盐渍辣椒的标准化生产，中、低盐再加工品的提质以及盐渍辣椒的微生物多样性等逐渐引起从业人员的重视[2-7]。

现阶段微生物多样性研究报道多集中在环境土壤湖泊等领域[6-9]，而食品方向以酿酒领域居多，发酵蔬菜类以韩国泡菜居多[8-15]，而发酵辣椒多样性研究鲜见。454 焦磷酸测序技术测序已成熟应用到微生物菌落鉴定中，能有效分析出样品生态环境中原始微生物的组成及其比重[15-19]。赵玲艳等[2]研究发现线椒自然发酵过程中的真菌可归属到39 个属、56 个种，优势真菌为汉逊酵母属，米椒自然发酵过程中的真菌可归属到60 个属、96个种，优势真菌为汉逊酵母属和毕赤酵母属。

本研究采用454 焦磷酸测序技术研究盐渍辣椒中真菌多样性，以确定盐渍辣椒中真菌群落结构及相对丰度。在此基础上，研究盐渍辣椒细菌多样性，分析高盐腌渍辣椒过程中微生物群落结构及相对丰度的变化，为安全生产腌渍辣椒，保障产品质量，提高风味提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验原料

盐渍米椒（C.annuum L.var.dactylus M）、盐渍线椒（C.annuum L.var.conoides Irish），湖南坛坛香食品科技有限公司。

1.2 主要试验试剂

E.Z.N.A.®Soil DNA 试剂盒、TransStart Fastpfu DNA 聚合酶、AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒、Roche GS FLX Titanium emPCR 试剂盒、Manual_XLR70 试剂盒，美国Omega Bio-Tek 公司。

1.3 仪器与设备

DYY-6C 型凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂；GeneAmp®9700 型PCR 仪，美国ABI；QuantiFluorTM-ST 荧光定量系统，美国Promega；Roche GS FLX 测序仪，瑞士Roche。

1.4 方法

1.4.1 样品采集本研究以盐渍线椒及盐渍米椒为对象，选择色泽、风味较好的样品，无菌操作取样带回实验室，-80 ℃冰箱保存[2]。

1.4.2 理化指标的测定总酸：参照GB/T 12456-2008[20]测定；NaCl：参照GB/T12457-2008[21]测定；水分：直接干燥法测定；辣椒素：参照GB-T 21266-2007[22]测定。

1.4.3 样品中微生物DNA 的提取参照OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA 试剂盒抽提方法提取DNA[22-25]。

1.4.4 扩增产物定量及测序正反向引物（27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，533R 5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），带有5’端454测序A、B 接头的特异引物和3’端的融合引物，其中A 为测序端，需要加上条码（barcode），B 端引物可以共用[26-28]。PCR 采用20 μL 反应体系。

1.4.5 PCR 产物定量、测序 PCR 产物荧光定量，要求总量＞100 ng，要求PCR 产物浓度＞5 ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0 左右，未降解，根据454 Roche GS-FLX 测序[28]。

1.4.6 生物信息分析方法数据采取Qiime[29]（vsesion 1.17 http：//qiime.org/）软件去杂，生物信息学分析以去除嵌合体、分类学分析、OTU 聚类、比对分析等[30-36]。计算α 多样性指数后，进行群落结构组分、绘制热图（Heatmap）、PCA 分析、丰度等级（Rank-Abundance）和多样性（Shannon-Wiener）曲线绘制等分析[33-36]。

2 结果与分析

2.1 盐渍米椒和线椒的理化指标测定结果

盐渍米椒和盐渍线椒的辣椒素、水分、总酸、食盐含量的变化见表1。从表1可以看出，盐渍米椒的辣椒素含量为26 120 SHU，水分含量为65.10%，总酸含量为0.82%，食盐含量为14.48%；盐渍线椒的辣椒素含量为2 412 SHU，水分含量为73.18%，总酸含量为0.15%，食盐含量为21.61%。

2.2 盐渍线椒和米椒细菌和真菌的稀疏性曲线

盐渍线椒和盐渍米椒细菌和真菌的稀疏性曲线见图1。由图1可以看出，当细菌测序量增加到5 000，真菌测序量增加到2 000 左右时，测序数据达到饱和，试验设定细菌10 000 条序列、真菌5 000 条序列的测序深度是合理的。盐渍线椒细菌和真菌稀疏性曲线分别比盐渍米椒细菌和真菌的稀疏性曲线陡、高，盐渍线椒的细菌和真菌多样性分别高于盐渍米椒的细菌和真菌多样性。

表1 盐渍辣椒的理化指标测定结果Table 1 Physical and chemical indicator results of salted pepper

图1 97%相似水平下盐渍辣椒细菌和真菌稀疏性曲线Fig.1 Sparsity curve of bacteria and fungi in salted pepper at 97% similarity level

2.3 盐渍米椒和线椒真菌多样性评估结果

优化序列在相似度97%的水平下进行OTU聚类，从表2可以看出，盐渍线椒和盐渍米椒的真菌OTUs 数分别为304 个和18 个，盐渍线椒中真菌的OTU 数分别大于盐渍米椒真菌的OTU 数；盐渍线椒和米椒真菌OUT 值小于ACE 值和Chao1 值，说明在盐渍线椒和米椒中可能存在很多未知的微生物资源；盐渍线椒细菌的ACE 和Chaol 指数大于盐渍米椒，Shannon 指数小于盐渍米椒，Simpson 大于盐渍米椒，说明盐渍线椒的真菌丰富度（richness）大于盐渍米椒，盐渍米椒的真菌均衡度（Species eveness）高于盐渍线椒。

表2 盐渍辣椒在97%相似性水平下真菌的多样性指数Table 2 Diversity index of fungi in salted pepper at 97% similarity level

2.4 盐渍线椒和米椒的真菌群落多样性分析结果

2.4.1 盐渍线椒和米椒在门水平真菌群落组成盐渍线椒和米椒的真菌18S rDNA 基因经过焦磷酸测序和分类学分析后，在门分类水平，相对丰度大于0.01%的真菌见图2。盐渍线椒已知分类的真菌可归属到2 个门、13 个纲、17 个目、31 个科、45 个属、87 个种。盐渍米椒已知分类的真菌可归属到1 个门、1 个纲、2 个目、2 个科、2 个属、1 个种。其中盐渍线椒真菌门类（phylum）主要包括：子囊菌门（Ascomycota，73.63%）、担子菌门（Basidiomycota，23.42%），其它（Unclassified）占真菌序列总数的2.95%。盐渍米椒只有1 个已知分类真菌门类：子囊菌门（Ascomycota，99.96%）。

图2 在门水平相对丰度大于0.01%的真菌群落组成Fig.2 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the phylum level

2.4.2 盐渍线椒和米椒在纲水平真菌群落组成在纲水平，盐渍线椒和盐渍米椒相对丰度大于0.01%的真菌见图3。从图3可以看出，在纲水平，盐渍线椒中相对丰度大于0.01%的真菌有酵母纲（Saccharomycetes，35.23%）、座囊菌纲（Dothideomycetes，29.78%）、银耳纲（Tremellomycetes，21.27%）、粪壳菌纲（Sordariomycetes，5.68%）、无分类（Unclassified 5.22%）、柄锈菌亚门（Pucciniomycotina，1.72%）、锤舌菌纲（Leotiomycetes，0.43%）、伞型束梗孢菌纲（Agaricostilbomycetes，0.13%）、其它（Others，0.1%）、散囊菌纲（Eurotiomycetes，0.08%）、外担菌纲（Exobasidiomycetes，0.07%）、伞菌纲（Agaricomycetes，0.02%）；盐渍线椒中相对丰度大于0.01%的真菌有酵母纲（Saccharomycetes，99.89%）、无分类（Unclassified，0.11%）。

图3 在纲水平相对丰度大于0.01%的真菌群落组成Fig.3 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the class level

2.4.3 盐渍线椒和米椒在目水平真菌群落组成在目水平，盐渍线椒和盐渍米椒相对丰度大于0.01%的真菌见图4。从图4可以看出，在目水平，盐渍线椒中相对丰度大于0.01%的已知分类地位的真菌有酵母目（Saccharomycetales，35.23%）、格孢腔菌目（Pleosporales，22.82%）、银耳目（Tremellales，20.02%）、煤炱目（Capnodiales，6.75%）、小丛壳目（Glomerellales，5.15%）、担孢酵母目（Erythrobasidiales，1.58%）、线黑粉菌目（Filobasidiales，1.25%）、其它（Others，0.85%）、柔膜菌目（Helotiales，0.43%）、黑粉菌目（Agaricostilbomycetes_in certae_sedis，0.13%）、刺盾炱目（Chaetothyriales，0.08%）、锁掷酵母目（Sporidiobolales，0.08%）；盐渍米椒中相对丰度大于0.01%的已知分类地位的真菌有酵母目（Saccharomycetales，99.89%）、无分类（Unclassified，0.11%）。

图4 在目水平相对丰度大于0.01%的真菌群落组成Fig.4 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the order level

2.4.4 盐渍线椒和米椒在科水平真菌群落组成在科水平，盐渍线椒和盐渍米椒相对丰度大于0.01%真菌见图5。在科水平，盐渍线椒中相对丰度大于0.01%的已知分类地位的真菌有毕赤酵母科（Pichiaceae，25.78%）、孢腔菌科（Pleosporaceae，22.23%）、有丝分裂银耳科（Mitosporic_Tremellales，18.15%）、有丝分裂酵母科（Mitosporic_Saccharomycetales，7.82%）、新球腔菌科（Davidiellaceae，6.27%）、未分类（Unclassified，5.42%）、其它（Others，4.72%）、小丛壳科（Glomerellaceae，4.4%）、银耳科（Tremellaceae，1.85%）、红担子科（Erythrobasidiaceae，1.58%）、金丝酵母科（Debaryomyc etaceae，0.95%）、酵母科（Saccharomycodaceae，0.15%）、有丝分裂伞型束梗孢菌亚纲（Mitosporic_Agaricostilbomycetidae，0.13%）、有丝分裂锁掷酵母科（Mitosporic_Sporidiobolales，0.08%）；盐渍线椒中相对丰度大于0.01%的已知分类地位的真菌有有丝分裂锁掷酵母科（Mitosporic_Sporidiobolale，93.49%）、金丝酵母科（Debaryomycetaceae，0.06%）、无分类（Unclassified，6.09%）、其它（Others，0.37%）。

图5 在科水平相对丰度大于0.01%的真菌群落组成Fig.5 The relative abundance of fungi is more than 0.01% at the family level

2.4.5 盐渍线椒和米椒在属水平真菌群落组成在属水平，盐渍线椒和米椒相对丰度大于0.01%的真菌群落组成和相对丰度见图6。盐渍线椒相对丰度大于0.01%的真菌有12 个属，分别为：毕赤酵母属（Pichia，25.78%）、链格孢属（Alternaria，21.85%）、汉纳酵母属（Hannaella，10.55%）、假丝酵母属（Candida，7.82%）、隐球酵母属（Cryptococcus，6.92%）、枝孢属（Cladosporium，6.27%）、刺盘孢属（Colletotrichum，4.4%）、不勒担孢酵母（Bulleromyces，1.83%）、掷孢酵母属（Sporobolomyces，1.57%）、Dioszegia（1.15%）、未分类（Unclassified，5.47%）、其它（Others，6.4%）。盐渍米椒优势真菌只有假丝酵母属（Candida，93.49%）。另从图7中可清楚看到相对丰度大于1%时，两者的差别更加明显。

图6 在属水平盐渍辣椒细菌（大于0.01%）群落组成和相对丰度Fig.6 Community composition and relative abundance of bacteria （more than 0.01%） in salted pepper at genus level

2.4.6 盐渍线椒和盐渍米椒真菌前100 个OTUs Heatmap 分析盐渍线椒和盐渍米椒真菌前100个OTUs 相似性聚类结果见图8。盐渍线椒和盐渍米椒真菌前100 个OTUs 经聚类分析后发现：前100 个细菌OTUs 中，盐渍线椒中含有75 个，盐渍米椒中含有48 个，盐渍线椒和盐渍米椒中共同含有的细菌OTUs 有23 个。盐渍线椒中共检测到47个真菌OTUs，盐渍米椒中共检测到4 个真菌OTUs。盐渍线椒中真菌主要以毕赤酵母属（Pichia，25.78%）、链格孢属（Alternaria，21.85%）和汉纳酵母属（Hannaella，10.55%）为主，盐渍米椒中真菌主要以假丝酵母属（Candida，93.49%）为主。分析对比盐渍线椒及米椒数据情况，发现盐渍线椒和米椒中参与发酵的真菌种类明显不同，相对丰度差异也较大。

图7 盐渍辣椒优势真菌（相对丰度大于1%）属群落组成和相对丰度Fig.7 The dominant fungi （relative abundance is more than 1%） belong to community composition and relative abundance of salted pepper

3 结论

盐渍线椒的食盐含量为21.61%，总酸含量为0.15%，水分含量为73.18%；盐渍米椒的食盐含量为14.48%，总酸含量为0.82%，水分含量为65.10%，虽然盐渍线椒的食盐含量高于盐渍米椒的食盐含量，但盐渍线椒中的微生物种类比盐渍米椒中的微生物种类丰富，推测其原因可能是盐渍米椒的高酸和低水分含量抑制了部分微生物生长。

盐渍线椒和盐渍米椒的真菌经454 焦磷酸测序分析和序列优化处理后，盐渍线椒和盐渍米椒优化后的真菌序列分别为12 659 条和7 047 条，真菌序列平均长度为430 bp。

盐渍线椒已知分类的真菌可归属到2 个门、13 个纲、17 个目、31 个科、45 个属、87 个种。盐渍米椒已知分类的真菌可归属到1 个门、1 个纲、2个目、2 个科、2 个属、1 个种。盐渍线椒优势菌门为子囊菌门（Ascomycota，73.63%）和担子菌门（Basidiomycota，23.42%），其它为未分类（Unclassified）占真菌序列总数的2.95%。盐渍米椒只有1个已知分类真菌门类：子囊菌门（Ascomycota，99.96%）。盐渍线椒优势真菌属为：毕赤酵母属（Pichia，25.78%）、链格孢属（Alternaria，21.85%）、汉纳酵母属（Hannaella，10.55%）、假丝酵母属（Candida，7.82%）、隐球酵母属（Cryptococcus，6.92%）、枝孢属（Cladosporium，6.27%），盐渍米椒优势真菌只有假丝酵母属（Candida，93.49%）。