双蛋白对异基因造血干细胞移植小鼠造血及免疫重建的影响

武小亮，卢林纲，王 靖，张婧婕，侯清华，韩 娟

（农业农村部食物与营养发展研究所 北京100081）

异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）是治疗恶性血液肿瘤，如白血病、淋巴瘤等的有效治疗手段[1]。移植前的放疗和化疗，青春期后胸腺功能的退化，供受体主要组织复合物不相容，移植排斥等多种因素，影响移植后免疫功能缺陷的严重程度和持续时间[2-3]。长期的免疫缺陷会导致由机会性感染所引起的较高风险的死亡率[4-5]。免疫功能的损伤修复，特别是淋巴细胞亚群的恢复往往影响移植后患者总体生存率。加快移植后患者造血及免疫重建对提高移植成功率具有十分重要的意义。

造血干细胞移植前的清髓处理，一方面导致患者肠胃功能紊乱，影响营养摄取；另一方面增加的蛋白消耗，引起患者负氮平衡[6-7]，以上不良结果可能导致移植后患者免疫重建时间延长。另外，研究表明白血病患者若营养不良就会导致糟糕的治疗结果[8]。白血病患者造血干细胞移植后，需要良好的营养状态以加快机体损伤修复和促进造血及免疫功能重建，蛋白营养在其中扮演重要角色。

优质动、植物蛋白质具有提高机体免疫力及增加肌肉合成等的生理功能。优质动、植物蛋白的代表，如大豆分离蛋白与乳清蛋白均具有较高的营养价值，能够提高机体免疫功能[9-10]。将大豆分离蛋白和乳清蛋白这2 种优质动、植物蛋白混合成双蛋白营养补充物，探究其对白血病患者骨髓移植术后的营养支持和干预作用。最近的临床研究发现，经造血干细胞移植的白血病患者服用双蛋白营养补充剂后，双蛋白能够促进患者造血植入，提高患者血清中蛋白含量，具有降低患者感染的趋势[11]。此研究在一定程度上表明双蛋白营养补充有利于造血干细胞移植后患者的预后。造血干细胞移植后免疫重建状况决定着移植成功率，双蛋白营养补充对造血干细胞移植后造血及免疫重建的作用如何尚未见报道。本文通过建立异基因造血干细胞移植小鼠模型，设计双蛋白营养干预动物实验，评估双蛋白在骨髓造血干细胞移植术后对小鼠造血及免疫功能恢复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

供鼠为SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，体重21～23 g；受鼠为SPF 级雄性BALB/c 小鼠，体重21～23 g。供鼠和受鼠均购于维通利华实验动物技术有限公司。所有小鼠饲养在中国医学科学院天津放射医学研究所实验动物中心，均按照SPF 级饲养标准进行动物饲养。环境适应1 周后开始实验，实验预处理7 d 前开始饮用庆大霉素水直到实验结束。

1.2 试剂药品与仪器

双蛋白复合营养粉（Dual-protein food nutrition power）由农业农村部食物与营养发展研究所中国农业科学院双蛋白工程技术研究中心研制，北京康比特体育科技股份有限公司生产。以高品质大豆分离蛋白和乳清蛋白为主要营养基料，辅以膳食纤维和功能性营养物质，经科学配方制作而成，营养成分含量如表1所示。

表1 营养成分表Table 1 Nutrition information

流式细胞术所需抗体PE-H-2Kb、APC-H-2Kd、BV510-Sca1、BV421-CD34、APC-CD Flk3、FITC-Lineage，美国Bio Legend 公司；PE-cKit，美国Tonbo Bio 公司；血细胞分析用溶血素，同生时代生物技术公司；小鼠脾组织处理用Spleen Dissociation Kit，美国Miltenyi 公司；庆大霉素粉末，中国KEHBIO 公司；总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒，上海科华生物工程股份有限公司；免疫球蛋白（IgA、IgE、IgG）检测试剂盒，北京金海科隅生物科技发展有限公司。

DxFLEX 流式细胞仪，美国BECKMAN COULTER 公司；BC-2600 全自动血细胞分析仪，Mindray（中国）公司；KHB-1280 全自动生化分析仪、KHB L-3180 半自动生化分析仪，上海科华生物工程股份有限公司。

1.3 异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）

将供鼠C57BL/6（H-2Kb）采用颈椎脱位法处死后，置于75%酒精中浸泡消毒15 min；在超净工作台上无菌取出股骨、胫骨，剔除肌肉组织后用眼科剪剪开骨头骨骺，使骨髓腔暴露，用注射器吸取RPMI-1640 培养液并反复冲洗骨髓腔直至发白，收集冲洗后液体于无菌15 mL 离心管中，充分吹打后将骨髓细胞悬液以1∶1 比例缓慢贴壁加入Ficoll 淋巴细胞分离液表面，水平离心 （2 000 r/min，20 min），取中间白膜层细胞；离心后得骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2.5×107/mL；受鼠BALB/c（H-2Kd）小鼠接受8 Gy（分2 次照射，每次4 Gy，间隔4 h）γ 射线全身辐照，剂量率为0.89 Gy/min；辐照后4～6 h 经尾静脉注射5×106个供鼠骨髓细胞（200 μL/只）。

1.4 双蛋白营养干预实验

将75 只BALB/c 小鼠随机分成3 组：正常对照组（CON）、造血干细移植组（HSCT+NP）、造血干细胞移植+双蛋白干预组（HSCT+PP），每组25 只小鼠。造血干细胞移植后第1 天开始进行蛋白营养干预，根据蛋白粉在生理盐水中的最大溶解度，HSCT+PP 组小鼠给予蛋白的质量浓度为335 mg/mL 的灌胃处理，灌胃量为200 μL/只；其余2 组小鼠均给予等体积的生理盐水。造血干细胞移植术后连续喂养4 周，每周检测各组小鼠血常规及体重变化情况，每2 周随机处死各组6 只小鼠，取小鼠全血测定供体嵌合率，剩余血液用于收集血清检测生化指标。解剖后取其相应组织器官用于测定脾脏和胸腺指数，并在第4 周分离骨髓细胞，测定小鼠造血干细胞各细胞亚型的含量和组成。

1.5 体重及血常规测定

各组小鼠每周称量体重后，内眦采血50 μL于0.5 mL 肝素钠抗凝管中，全自动血细胞分析仪测定各组小鼠各类血细胞计数。

1.6 器脏指数测定

摘眼球取血后，脱颈处死小鼠，解剖取其脾脏和胸腺，滤纸拭去组织表面残余血液和其它液体，称量湿重，计算脾脏指数和胸腺指数。

1.7 血清生化指标测定

采集各组小鼠外周血于1.5 mL 离心管中，2 000×g 离心10 min，收集血清。测定血清样品总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及IgM、IgA、IgG 的含量。所有检测均按照试剂盒使用说明书进行操作。

1.8 流式细胞术

供体嵌合率分析：使用MACS 组织解离试剂盒结合gentle MACS C 管和美天旎组织处理器，将脾脏处理成单细胞悬液，用70 μm 过滤器过滤，用15 mL 试管收集细胞悬液；1 500 r/min 离心5 min，弃上清后加入1 mL PBS 重悬细胞，取100 μL 细胞悬液加入事先预混好的含有H-2Kd（APC） 和H-2Kb （PE） 的抗体中，常温孵育15 min；加入2 mL 红细胞裂解液，裂解10 min，1 500 r/min 离心5 min，弃上清后1 mL PBS 重悬细胞。洗1 遍，弃上清，加入200 μL PBS 重悬细胞并上机检测。

造血干细胞含量分析：取处死后的小鼠后腿股骨，剔除肌肉组织，用眼科剪剪开骨头骨骺，使骨髓腔暴露，用注射器吸取RPMI-1640 培养液冲出骨髓细胞，反复吹打成单细胞原液，收集细胞悬液于15 mL 离心管中；1 500 r/min 离心5 min，弃上清后，加入1 mL PBS 重悬细胞，取100 μL 细胞悬液加入事先预混好的含有Lin-FITC、c Kit-PE、BV-510-Sca1、BV-421-CD34、APC-Flk3 的抗体中，常温孵育15 min；其余步骤与脾脏流式操作完全相同。其中Lin-c-kit+sca1+代表造血干细胞（HSC）；Lin-c-kit+Sca1+CD34-Flt3-代表长期造血干细胞（LT-HSC）；Lin-c-Kit+Sca1+CD34+Flt3-代表短期造血干细胞 （ST-HSC）；Lin-c-Kit+Sca1+CD34-Flt3-代表多能祖细胞（MPP）。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，2 组数据采用t 检验，2 组以上数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD 多重比较法进行均值比较。各组数据均采用±s 表示，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 双蛋白粉对小鼠造血干细胞移植后体重和供体嵌合率的影响

如图1a 所示，各组小鼠在移植后第7 天体重降至最低值，而后体重不断回升，组间体重变化无明显差异 （P>0.05），然而移植后第21，28 天HSCT+PP 组小鼠体重均高于HSCT+NP 组小鼠。如图1b 所示，移植后第14，28 天2 组小鼠供体嵌合情况无明显差异，然而蛋白干预组小鼠在第28天供体嵌合率高于未干预组 （分别为91.0%±1.1%，85.5%±4.5%，P>0.05）。以上结果表明，双蛋白营养干预在一定程度上有利于造血干细胞移植术后小鼠体重的恢复，同时有利于提高移植后小鼠供体嵌合率，促进造血干细胞植入。

图1 双蛋白对小鼠造血干细胞移植后体重及供体嵌合率的影响Fig.1 Effect of double protein on body weight and donor chimerism in mice after hemopoietic stem cell transplantation （HSCT）

2.2 双蛋白对造血干细胞移植后小鼠血细胞数量恢复的影响

经过物理辐照后，小鼠造血系统受到完全损伤，血细胞被破坏清除，射线照射后外周血细胞数量逐渐降低，骨髓移植后各组血细胞数量仍继续降低到达最低值后逐渐恢复，经历了一个动态变化的过程。如图2所示，移植后第7 天除红细胞外，其它各类细胞计数均降至最低值且组间无显著差异，而后均逐渐恢复。HSCT+PP 组小鼠在移植后第14 天白细胞（WBC）和淋巴细胞（LYMPH）数目显著高于HSCT+NP 组小鼠（P＜0.05）；此外，第21，28 天2 类细胞数量均高于HSCT+NP 组小鼠而无显著差异（图2a，图2d）。移植后21 d 红细胞计数HSCT+PP 组极显著高于HSCT+NP 组（P＜0.01），第28 天显著高于HSCT+NP 组小鼠（P＜0.05）（图2b）。如图2c 所示，HSCT+PP 组小鼠在移植后各个时间点血小板（PLT）计数均显著高于HSCT+NP 组小鼠（P＜0.05）。2 组小鼠中性粒细胞（NEUT）和单核细胞（MONO）计数在各时间点无显著差异。以上结果表明：造血干细胞移植后双蛋白营养干预有利于小鼠WBC、RBC、PLT、LYMPH数量恢复，尤其对PLT 数量恢复最为明显，对NEUT 和MONO 数量恢复虽无显著差异，但双蛋白干预组展现更好的恢复趋势。

图2 双蛋白粉对小鼠造血干细胞移植后血细胞计数的影响Fig.2 Effect of double protein on the number of peripheral blood cells of mice after HSCT

2.3 双蛋白对骨髓移植后小鼠造血干细胞含量和组成的影响

上述实验结果表明，双蛋白营养支持加快了骨髓移植后小鼠造血干细胞植入和部分血细胞数目和类型的恢复。为探究双蛋白发挥这一作用的功效机理，进一步对移植后第28 天各组小鼠造血干细胞含量和亚型进行分析。结果如图3所示，HSCT+PP 组小鼠造血干细胞（LSK，Lin-Sca1+ckit+）总量高于HSCT+NP 组（分别为4.26%±1.22%，3.69%±0.57%，P＞0.05）；长期造血干细（Lin-c-kit+Sca1+CD34-Flt3-，LT-HSCT） 和短期造血干细胞（Lin-cKit+Sca1+CD34+Flt3-，ST-HSC） 在2 组小鼠中含量相当，无显著差异；而多能祖细胞（Linc-Kit+Sca1+CD34-Flt3-，MPP）HSCT+PP 组小鼠含量显著高于HSCT+NP 组 （分别为0.37%±0.23%，0.19%±0.04%，P＜0.05）。以上结果表明，造血干细胞移植后双蛋白营养支持有利于提高小鼠造血干细胞（LSK）和多潜能造血祖细胞（MPP）的含量，说明双蛋白促进了造血干细胞的定植、增殖和分化，进一步促进了移植后HSCT+PP 组血细胞数量的恢复。

图3 双蛋白对骨髓移植后小鼠骨髓中造血干细胞比例的影响Fig.3 Effect of double protein on the percentage of HSCs of bone marrow in mice after HSCT

2.4 双蛋白对小鼠造血干细胞移植后脏器指数的影响

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其大小能够在一定程度上反应机体免疫功能状态[12-14]。因此，对移植后第14，28 天各组小鼠的胸腺和脾脏进行称重并计算器脏指数。结果如图4a 所示，移植后HSCT+PP 组和HSCT+NP 组小鼠胸腺均发生不同程度的萎缩，且HSCT+NP 组小鼠胸腺萎缩明显。移植后第14 天，HSCT+NP 组小鼠胸腺指数极显著低于CON 组小鼠 （分别为0.47±0.53，1.04±0.15，P＜0.05），同时也低于HSCT+PP 组小鼠（分别为0.47±0.53，0.85±0.13，P＞0.05），然而无显著差异。在移植的第28 天，HSCT+NP 组小鼠胸腺指数均极显著低于CON 组和HSCT+PP 组小鼠 （分别为0.48±0.6，1.26±0.7 以及0.48±0.6，1.05±0.7，P＜0.01）。与此同时，HSCT+NP 组小鼠胸腺指数随移植后时间的推移基本没有任何变化，而HSCT+PP组小鼠胸腺指数逐渐恢复至正常水平。对于脾脏指数而言，3 组小鼠的脾脏指数在移植后的第14，28 天无明显差异（图4b）。以上结果表明，双蛋白营养干预有利于造血干细胞移植后小鼠胸腺指数恢复，减小胸腺萎缩。

图4 双蛋白粉对小鼠造血干细胞移植后小鼠胸腺和脾脏指数的影响Fig.4 Effect of double protein on thymus and spleen index of mice after HSCT

2.5 双蛋白对小鼠造血干细胞移植后血清生化指标的影响

如表2所示，造血干细胞移植后第28 天，HSCT+NP 组小鼠血清总蛋白（TP）含量低于对照组和HSCT+PP 组，且显著低于CON 组。HSCT+PP组和HSCT+NP 组小鼠血清白蛋白（ALB）显著低于对照组。各组小鼠血清AST、ALT 含量无显著差异。移植组小鼠的IgG 和IgA 含量均低于对照组，而无显著差异。HSCT+PP 组小鼠IgM 含量高于其它2 组，且显著高于HSCT+NP 组小鼠。以上结果表明，造血干细胞移植后小鼠血清TP、ALB、IgG、IgA、IgM 含量均会发生不同程度降低，双蛋白营养支持具有提高其含量的趋势。

表2 造血干细胞移植后第28 天各组小鼠血清生化指标结果（±s）Table 2 Serum biochemical indices of each group on day 28 after HSCT （±s）

表2 造血干细胞移植后第28 天各组小鼠血清生化指标结果（±s）Table 2 Serum biochemical indices of each group on day 28 after HSCT （±s）

注：数值后不同小写字母表示具有显著差异（P＜0.05）。

指标 组别对照组 HSCT+PP HSCT+NP总蛋白（TP）/g·L-1 64.82±1.26a 62.63±0.38ab 60.85±0.63b白蛋白（ALB）/g·L-1 37.30±0.40a 33.80±0.88b 33.10±0.57b谷草转氨酶（AST）/U·L-1 57.36±4.85 63.07±3.87 58.09±3.11谷丙转氨酶（ALT）/U·L-1 48.96±3.69 49.25±1.45 45.38±0.84免疫球蛋白G（IgG）/g·L-1 2.60±0.19 2.45±0.67 2.37±0.85免疫球蛋白A（IgA）/g·L-1 1.48±0.50 1.44±0.52 1.36±0.43免疫球蛋白M（IgM）/g·L-1 0.34±0.01ab 0.36±0.00a 0.33±0.00b

3 讨论

异基因造血干细胞移植是治疗恶性血液病肿瘤的潜在治疗手段，然而移植后长期的免疫缺陷是移植后导致疾病复发率和死亡率高的主要因素之一，并且使患者较易受机会性感染所导致的不良影响[1，15-16]。因此，加快血液病患者造血干细胞移植后造血及免疫重建具有十分重要的意义。造血干细胞移植前的放化疗清髓处理，导致患者肠胃功能紊乱，影响营养物质吸收，并致使患者出现负氮平衡现象[8-9]。因此，移植后蛋白营养补充显得非常重要。乳清蛋白消化吸收效率快，氨基酸释放迅速，而大豆分离蛋白消化吸收相对缓慢，氨基酸前期释放虽缓慢，但持续性较好，2 种蛋白混合后，能够互补两者在氨基酸释放上的优势，有利于氨基酸持续性的供给[17]。对于蛋白营养制品有利于提高免疫功能的研究经常被报道[18-20]，最近在临床研究中发现，白血病患者经过造血干细胞移植治疗后，服用双蛋白有利于促进造血植入，改善蛋白质-能量营养不良症，并提高血清蛋白水平[11]，这与本实验结果相一致。双蛋白是否有利于造血干细胞移植后患者造血及免疫重建尚未见报道。因此，本研究建立异基因造血干细胞移植动物模型，进行双蛋白营养干预，探究双蛋白营养补充对移植后小鼠造血和免疫重建的影响。

研究结果表明，双蛋白对骨髓移植后小鼠体重恢复及供体嵌合率具有正向促进作用，同时能够促进移植后小鼠外周血血细胞的恢复，尤其对血小板的恢复作用最为明显，说明双蛋白营养支持有利于移植后小鼠造血干细胞植入和造血功能重建。外周血所有血细胞均由骨髓中造血干细胞分化而来[21]，因此，外周血血细胞的重建与骨髓中造血干细胞的含量密切相关[22]。通过对移植后28 d 各组小鼠造血干细胞含量的分析发现双蛋白干预组（HSCT+PP）的造血干细胞（LSK cell）和多潜能祖细胞（MPP）含量多于未干预组（HSCT+NP）小鼠，这可能解释了HSCT+PP 组小鼠血细胞恢复快于HSCT+NP 的原因。脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官，其器官完整性反应了机体免疫功能状况[23-24]。造血干细胞移植前的清髓处理导致患者胸腺发生萎缩，从而延缓T 细胞重建[25]。通过对移植后第14，28 天各组小鼠胸腺和脾脏指数分析发现，胸腺指数结果与邓红等[26]的研究结果十分相似，蛋白营养干预能够提高老年大鼠的胸腺指数，而在本研究中发现双蛋白营养干预能够显著提高移植后小鼠胸腺指数。这在一定程度上说明，双蛋白营养补充有利于促进免疫器官损伤修复，提高机体免疫功能，其发挥作用的靶点可能主要在胸腺。

免疫球蛋白是动物免疫系统在抗原刺激下，由B 细胞或记忆B 细胞增殖分化成的浆细胞所产生的，是机体免疫应答的主要效应分子，其含量直接反映机体免疫功能状态[21，27]。造血干细胞移植后，在各组小鼠经历免疫系统的重建过程中，通过对血清免疫球蛋白含量的分析，来反应小鼠免疫重建状况。结果发现，HSCT+PP 组小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 的含量均高于HSCT+NP 组，且IgM 含量显著高于HSCT+NP 组。这与蛋白质粉对老龄大鼠抗衰老作用的研究中[28]，蛋白粉营养补充能够提高大鼠血清IgG、IgA、IgM 含量，且显著提高IgM 含量的结果完全相同。2 项研究均表明大豆分离蛋白与乳清蛋白的混合蛋白能显著提高相关动物模型的血清免疫蛋白含量，尤其是IgM 含量。这可能与蛋白补充后可改善机体氨基酸水平有关[29]，具体机制还需要进一步研究加以阐述。另外，本研究中造血干细胞移植的小鼠血清蛋白含量低于正常组小鼠，表明移植组小鼠蛋白合成能力降低，机体营养状态下降[30]。HSCT+NP 组小鼠血清总蛋白含量显著低于正常组小鼠，而HSCT+PP 组与正常组无明显差异，且TP 含量高于HSCT+NP 组小鼠，表明双蛋白营养干预提高了造血干细胞移植后小鼠血清的TP 含量。

通过本研究，证明了大豆分离蛋白与乳清蛋白形成的混合双蛋白能够加快造血干细胞移植后小鼠造血重建，并提高骨髓中造血干细胞含量，明显改善胸腺萎缩，增加小鼠胸腺指数和血清免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）和血清总蛋白（TP）含量。总之，双蛋白能够加快造血干细胞移植后小鼠造血及免疫功能重建和恢复。