间日疟原虫配子融合因子PvHAP2传播阻断效应的评估*

刘鹏波 张耀文 赵 艳 郁春云 曹雅明

(中国医科大学免疫学教研室，辽宁沈阳 110122)

疟疾是由疟原虫感染所引起的一种古老的严重危害人体健康的虫媒疾病(周吉坤等，2015)。仅在2018年，全世界大约有2.28亿例疟疾感染病例，其中有40.5万人死于疟疾。感染人类的多种疟原虫中，间日疟原虫在全球范围内的分布最广，且在非洲以外地区的感染病例最多(WHO，2020)。间日疟原虫具有复杂的生物学特性，感染早期配子体在出现症状前就出现在外周血使其拥有更长的传播窗口期。同时，它具有侵染网织红细胞的倾向性，因此很难获得体外连续培养，使开发有效的抗疟措施是一项极具挑战的任务。此外，有研究证据表明，间日疟原虫在中缅边境流行区已经出现了对氯喹等抗疟药物敏感性降低的现象(胡月，2016)。间日疟原虫在与恶性疟原虫共同流行地区的优势地位日益增强，突出了针对间日疟原虫开发新控制措施的必要性，包括开发出高效的疫苗等。然而，与恶性疟原虫相比，间日疟原虫疫苗的研发依然处于早期临床前阶段，疫苗新的候选抗原筛选依然是当前工作的重心。而在间日疟原虫感染早期不断产生有性阶段的雌、雄配子体对其实现有效的传播至关重要，这说明针对疟原虫有性阶段的传播阻断疫苗可能是消灭间日疟在人群中传播的一项重要措施。

传播阻断疫苗以疟原虫有性阶段以及按蚊中肠期蛋白为抗原。但目前为止，虽然研究了较多的传播阻断疫苗的候选抗原，但其中仅有一小部分表现出来传播阻断活性(TRA)。传播阻断疫苗的发展目前主要集中在疟原虫生命周期中的3个阶段，包括受精前抗原Pfs230(Farranceetal.，2011)和Pfs48/45(Outchkourovetal.，2008)，受精后抗原Pfs25(Wuetal.，2008)和Pfs28(Duffyetal.，1997)以及蚊中肠抗原AgAPN1(Dinglasanetal.，2007)。

最近研究表明，HAP2/GCS1蛋白具有成为新一代TBV候选抗原的潜质。HAP2/GCS1蛋白最初于拟南芥中发现(von Besseretal.，2006)，并且广泛存在于包括植物、多细胞生物、无脊椎动物、藻类以及致病性和非致病性原生生物在内的多种真核生物中。HAP2是由单一的跨膜结构域、胞外结构域和相对较短的胞内区所构成的高度保守的蛋白(Fédryetal.，2017, Fedryetal.，2018)。在对衣藻、拟南芥和四膜虫HAP2的结构和功能研究表明，HAP2是一种配子膜融合蛋白，与Ⅱ类病毒融合蛋白同源(Fédryetal.，2017, Pinelloetal.，2017, Fengetal.，2018)。在膜融合的过程中，一个由～40氨基酸(AA)保守区组成的疏水环结构发挥着重要的作用(Fédryetal.，2017)。HAP2存在于所有疟原虫的基因组中，伯氏疟原虫PbHAP2基因的破坏可以阻止按蚊中肠雌、雄配子的受精和随后在按蚊中的发育(Hiraietal.，2008, Liuetal.，2008)。PbHAP2是一种在雄性配子表面表达的雄性生育因子，为雌性和雄性配子膜融合所必需(Hiraietal.，2008, Liuetal.，2008)。虽然PbHAP2仅参与了配子的融合，并未参与雌、雄配子的黏附结合过程，同时抗PbHAP2抗体可在体内、外引起较强的传播阻断效应(TRA)(Blagboroughetal.，2009)。在小麦胚芽无细胞系统中表达的PfHAP2重组蛋白免疫小鼠后，得到的抗体在标准膜饲实验中也显示出强大的TRA(Miuraetal.，2013)效应。研究表明，针对保守的HAP2 cd环肽的抗体在伯氏疟原虫和恶性疟原虫系统中均显示出有效的TRA(Angrisanoetal.，2017) 效应，进一步强调参与疟原虫配子受精过程的II类融合蛋白是TBV的潜在候选抗原。

前期结果显示，通过杆状病毒表达系统表达的PvHAP2蛋白的抗体表现出了较为明显的传播阻断效应，表明PvHAP2具有作为传播阻断疫苗候选抗原的潜能。然而，杆状病毒表达系统高昂的代价明显不适合大规模蛋白表达，在一定程度上制约了其作为疫苗抗原生产系统的可行性。为进一步阐明不同表达系统表达的rPvHAP2蛋白所制备抗体的传播阻断活性，本文通过间日疟原虫重组rPvHAP2蛋白的原核表达和抗体血清制备，探讨其抗血清对间日疟原虫的传播阻断活性，结果证实了PvHAP2在间日疟原虫中的表达和定位情况，并初步揭示其作为传播阻断候选抗原的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选用的间日疟原虫临床分离株取自中缅边境间日疾患者，6～8周龄的雌性BALB/c小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。斯氏按蚊Anophelesstephensi由中国医科大学免疫学教研室恒温饲养。主要试剂辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和鼠抗His-tag单抗购自美国Invitrogen公司，异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、镍氨三乙酸琼脂糖柱、肝素钠及其余常规化学试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。限制性内切酶BamH IXhoL I购买自美国NEB公司；血液基因组DNA提取试剂盒选自北京天根生化科技有限公司。DNA纯化试剂盒(TaKala Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0)购买于日本TaKala公司。

1.2 目的基因的扩增以及原核表达载体pET32a-PvHAP2的构建

为表达重组蛋白rPvHAP2，在蛋白区域(231-459 aa)选取了一段229 aa的片段通过大肠杆菌原核表达系统进行表达。针对表达的片段以及原核表达载体 pET32α(+)合理设计合成引物PvHAP2-F(5′-caGGATCCGTGCCATCATGGATTTCTCC-3′)和PvHAP2-R(5′-ggCTCGAGAATAATTAACACATTTTTTCA-3′)并在稀释后用间日疟原虫基因组充当模板进行扩增。扩增体系包括 1.5 μL 10 μmol/L引物PvHAP2-F，1.5 μL 10 μmol/L引物PvHAP2-R，5 μL 2 mmol/LdNTPs，5 μL 10×buffer，3 μL 25 mmol/L MgSO4，2 μL DNA模板，1 μL PCR-Plus-Neo，ddH2O补至50 μL。PCR 反应程序如下:先于98 ℃ 预热2 min；然后98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 30 s，35个循环；最后68 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，根据产物的大小切下目的基因片段，并按DNA纯化试剂盒的标准操作流程进行 PCR产物的回收。之后用BamH Ι和XhoL I限制性核酸内切酶对回收所得的目的基因和原核表达载体pET32a(+)进行双酶切处理并回收纯化，之后用T4 DNA连接酶将回收的片段克隆至原核表达载体pET32α(+)中。将连接好的产物转化至宿主菌DH5α中，采用菌体 PCR 的方法鉴定阳性克隆，并挑取阳性克隆扩大培养提取质粒，在双酶切鉴定后送北京华大基因测序，用DNA Star软件进行序列比对后，保存菌种备用。

1.3 重组蛋白rPvHAP2的表达和纯化

1.3.1重组蛋白rPvHAP2的表达：冻存的菌液3 μL接种于3 mL新鲜的LB培养基，加入氨苄抗生素后于 37 ℃下摇菌过夜，次日提取质粒转化入RGB原核表达宿主菌中。菌落PCR鉴定正确后，按1∶100的比例转接到新鲜的300 mL LB培养基，在37 ℃进行摇菌,当菌液OD值达到 0.4～0.6 时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，于19 ℃诱导8 h，10 000 r/min离心10 min收菌。向收集的菌体加入1×Ni-NTA 结合缓冲液重悬后在冰上进行超声破菌(540 W超声2 s，间隔3 s，全程时间20 min),破菌后的菌液在 4 ℃ 条件下12 000 r/min离心5 min，收取上清液样品。

1.3.2上清蛋白纯化：取5 mL 50%镍氨三乙酸琼脂糖柱Ni-NTA His·Bind Superflow悬液加入到20 mL 1×Ni-NTA 结合缓冲液中，轻轻混匀，在3 000 r/min离心5 min，吸去上清，重复2遍，以激活Ni-琼脂糖。加入经过无菌0.22 μm滤器推滤的20 mL rPvHAP2蛋白表达后的上清液，在恒温摇床上轻轻摇动混匀,于4 ℃结合60 min。加入5倍柱体积的1×Ni-NTA 洗杂缓冲液(含300 mmol/L NaCl与50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0)在混合器上洗涤10 min，此步骤重复3～4次。弃去洗杂缓冲液后用10 mL 1×Ni-NTA 洗脱缓冲液(300 mmol/LNaCl与50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0)进行蛋白洗脱，收集蛋白。将洗脱后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的 PBS 缓冲液中4℃进行梯度透析。

1.4 SDS-PAGA电泳和Western blot检测

将纯化后的rPvHAP2蛋白样品以每孔4 μg进行上样。用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白的纯化情况，浓缩胶在60 V电压下进行电泳，当到达分离胶后，将电压调到100 V，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝R-250染色30 min，脱色之后于凝胶成像分析仪上进行观察，从而分析蛋白质的表达及纯化情况。

纯化的重组蛋白用10%的SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕后，在4 ℃ 45 V恒压转膜3 h将蛋白样品转至PVDF膜上。以5%(m/V)的TBST(0.1 mol/L TBS, pH 7.4, 0.02% Tween 20)溶解脱脂奶粉在4 ℃封闭2 h。经TBST洗3次后，1∶2000稀释的鼠抗His-tag单抗(5%脱脂奶粉稀释)与PVDF膜4℃结合过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，1∶5000稀释HRP标记的山羊抗小鼠IgG(TBST稀释)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL发光的方法在荧光图像分析系统中检测。

1.5 多克隆抗体制备及血清抗体滴度检测

为了获得针对重组PvHAP2蛋白的抗血清，用50 μg的上述重组蛋白与弗氏完全佐剂充分混合后通过皮下注射的方式对BALB/c 雌性小鼠进行免疫，分别于第3、5周给予两次加强免疫，免疫方法为25 μg的PvHAP2 重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合后进行皮下免疫。于末次免疫后第7 d收集血清检测抗体滴度。多克隆抗体通过蛋白质A柱经行收集。用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释重组蛋白rPvHAP2(5 μg/mL)包被96孔酶标板，并于4 ℃过夜。经200 μL PBST(0.1 mol/L PBS，pH 7.4，0.02% Tween 20)洗板3次后，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭液在37 ℃ 封闭1 h。用PBST 洗3次后，加入用封闭液稀释的血清(稀释倍数从 1∶200 到 1∶25600)，每孔100 μL，于37 ℃孵育2 h。PBST 洗板 3 次后，加入HRP标记的羊抗鼠 IgG(1∶5000)，37 ℃ 孵育2 h。PBST洗板7次后，加入底物邻苯二胺和过氧化氢进行显色，100 μL稀H2SO4终止反应，酶标仪检测450 nm处OD值。

1.6 间接免疫荧光测定(IFA)

在中缅边境通过显微镜镜检疟原虫的方法招募间日疟原虫患者。在获得书面知情同意(Human Subject Assurance Number：FWA0001184)后，每名患者抽取5 mL静脉血，并在37℃下立即与2倍体积的悬浮缓冲液(10 mmol/L Tris，pH 7.4，170 mmol/L NaCl，10 mmol/L葡萄糖)进行充分混合，以避免雄配子体出丝。离心除去上清液后，将红细胞沉淀重悬于10 mL RPMI 1640培养基中。用47%Nycodenzs/RPMI 1640于500×g离心25 min以对重悬液进行分离。收集灰色界面处富含配子体细胞的组分，并用RPMI 1640洗涤3次。将分离出的配子体细胞点到多孔载玻片上，并用4%多聚甲醛和0.0075%戊二醛(Sigma)固定30 min。用甘氨酸/PBS(3.75 mg/mL)中和固定液中醛基后，0.1% Triton X-100 透膜10 min。PBS洗涤后，用3%BSA/PBS溶液于37℃封闭30 min。经PBS洗涤后，加入抗PvHAP2血清纯化的IgG(1∶500)孵育1 h。PBS洗涤后，将玻片与Alexa Fluor®488山羊抗鼠IgG抗体(1∶500)和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)在37℃孵育1 h。PBS洗涤后，将载玻片用ProLong防淬灭试剂盒固定，并使用荧光显微镜进行观察。免疫前血清用作IFA的阴性对照。

1.7 标准膜饲实验(SMFA)

在中缅边境招募间日疟感染的患者，在知情同意后，每个患者取10 mL的血液进行SMFA以评估抗PvHAP2抗体的传播阻断效果。纯化的抗PvHAP2的IgG用来自泰国志愿者的AB+人血清(热灭活去除补体后)以1∶1进行稀释，共180 μL。然后将稀释的IgG(11.7 μg/μL)样品与患者的红细胞混合(1∶1)，并在37℃孵育15 min后将混匀血液样品加入膜进样器。每个样品，由实验室饲养的50只饥饿的按蚊通过进样器进食30 min。喂食后，将未进食的按蚊去除，吸饱的按蚊饲养于温度为27℃，80%相对湿度条件下，给予10%蔗糖水。在第7 d每组解剖20只按蚊得到蚊中肠，用0.5%汞色素染色后在光学显微镜下计数在按蚊中肠上形成的卵囊数量。对照组用免疫前血清纯化的IgG作对照。

1.8 统计分析方法

使用Mann-WhitneyU检验分析对照组和PvHAP2 免疫组两组按蚊的卵囊数之间的差异。Student′st检验分析ELISA检测抗体滴度。按蚊感染率的计算方法为卵囊阳性按蚊在被解剖的全部按蚊中所占的百分比。Fisher′s的精确检验用于比较对照组和PvHAP2免疫组之间的感染率差异。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 pET32a-PvHAP2重组蛋白的表达

HAP2/GCS1的结构域具有重要功能，因此，我们选取了PvHAP2的229个氨基酸片段(231-459 aa)，它包含7个半胱氨酸但没有cd环的结构域。通过PCR的方法成功扩增得到了PvHAP2基因片段，经限制性内切酶BamHI和XhoL I进行双酶切后连接至线性化的pET32α载体(图1)，经华大测序正确后，冻菌备用。

图1 pET32α-PvHAP2 原核表达载体的构建流程图Fig.1 The protocol for recombinant pET32α-PvHAP2 plasmidA. pET32α原核表达载体质粒图谱；B.扩增的PvHAP2基因的DNA片段；C.构建好的pET32α-PvHAP2原核表达载体.A. The plasmid map of pET32α prokaryotic expression vector; B. The amplified DNA fragment of PvHAP2 gene; C. The constructed vector of pET32α-PvHAP2.

pET32α-PvHAP2表达载体经IPTG诱导，菌体超声破碎后。使用His-tag镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化重组蛋白，并对洗脱及透析后的样品进行SDS-PAGE 电泳检测，可清晰看到目标蛋白条带，蛋白纯度达到80%以上。同时使用Western blot对蛋白进行检测，验证了重组蛋白的正确表达(图2)。

图2 SDS-PAGE电泳和Western blot检测Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot analysis of purified rPvHAP2 proteinM：蛋白 Marker；Cont：未诱导菌液.M: Protein marker; Cont: Bacterial liquid without induction.

2.2 ELISA检测血清的抗体滴度

三次免疫后，通过眼球取血获得免疫后的血清纯化IgG。经ELISA检测表明，小鼠对重组PvHAP2蛋白具有较强的免疫应答。抗体滴度明显高于对照组，第3次免疫后抗体滴度达到1∶25600(图3)。结果表明，重组PvHAP2具有较好的免疫原性，可诱导雌性BALB/c 小鼠产生特异性抗体应答。

图3 抗PvHAP2 IgG抗体滴度检测Fig.3 The antibody titer of purified anti-PvHAP2 IgG

2.3 间接免疫荧光检测蛋白定位

为确定PvHAP2的表达和定位，在中缅边境招募间日疟患者收集血液样本后，使用密度梯度离心法分离得到间日疟原虫配子体进行IFA。结果表明对照组血清与配子体无反应，而抗PvHAP2血清可以识别雄性配子体，表明PvHAP2的免疫血清可以识别疟原虫天然抗原(图4)。

图4 间接免疫荧光检测PvHAP2在间日疟原虫配子体中的表达Fig.4 Indirect immunofluorescence for PvHAP2 expression in Plasmodium vivax gametocyteBF: 明视野; DAPI: 间日疟原虫细胞核经DAPI染色；FITC: 荧光显微镜绿色荧光视野；Merge: DAPI和FITC的合成图; Control: 免疫前血清分离的IgG(阴性对照).标尺为5 μm.BF: Bright field; DAPI: Nucleus stained with DAPI; FITC: gGreen fluorescence; Merge: DAPI+FITC. Control: IgG isolated from pre-immune serum was used as negative control. The scale is 5 μm.

2.4 标准膜饲实验评估传播阻断活性

为了评估抗PvHAP2的抗体是否可以阻断间日疟原虫向按蚊的传播。将纯化的IgG跟志愿者AB+血清混合后再与间日疟原虫患者血液混合，进行膜饲实验。结果显示，抗PvHAP2抗体表现出了TRA效应。与对照血清相比，抗PvHAP2的感染率降低25%，同时，抗PvHAP2抗体导致平均卵囊数降低15.3%(图5, 表1)。

图5 抗PvHAP2 IgG的传播阻断效应的评估Fig.5 The transmission blocking effects of purified anti-PvHAP2 IgG

表1 抗PvHAP2 IgG的传播阻断效应Tab.1 The transmission blocking effect of anti-PvHAP2 IgG

3 讨论

传播阻断疫苗以疟原虫有性阶段表面表达的分子为靶点，通过抑制其在按蚊宿主体内发育进而阻止其传播。目前，传播阻断疫苗(TBV)候选抗原主要集中配子和动合子等阶段的表面抗原，而对配子期表面抗原的研究较少。尽管配子表面抗原暴露于宿主抗体的时间相对较短(一般少于1 h)，但配子产生的抗体却具有很强的TRA(Munesingheetal.，1986)活性。参与受精过程的配子体蛋白(例如P230和P48/45)是表达在配子表面的具有成为TBV候选抗原潜能的分子靶点。P25和P28是动合子上的主要候选抗原，异源表达的P25和P28在实验动物体内产生的抗体可以抑制疟原虫在按蚊体内的生长发育(Kaslowetal.，1994, Hisaedaetal.，2000)。然而，在最近的一项临床试验中发现即使和EPA进行偶联，针对Pfs25产生的抗体的存在周期依然比较短，并且只有通过4次免疫后的标准膜饲实验才有传播阻断活性，而直接通过皮肤叮咬则不可以(Sagaraetal.，2018)。目前，间日疟原虫的TBV研究远远落后于恶性疟原虫，这主要是由于缺乏间日疟原虫体外培养系统。因此，大多数SMFA都是用野外分离株进行的。迄今为止，仅对间日疟原虫中的少数TBV候选基因进行了研究，并且几乎所有此类研究均基于恶性疟原虫同源蛋白的研究，而两者的生物学特性依然有很大差异。间日疟原虫的TBV研究集中在Pvs25和Pvs28。在这里，我们的结果表明，PvHAP2表达在雄性配子体上，同时抗血清具有一定的传播阻断活性，可以作为间日疟原虫TBV的候选抗原。

HAP2是一种在雄性配子中表达的雄性特异性分子。HAP2具有3个结构域，其中结构域II和III参与介导配子膜融合。在结构域II中的有一段～40 aa短肽为融合环(cd环)(Fédryetal., 2017)。研究表明，针对在大肠杆菌中表达的重组PbHAP2蛋白(aa 355-609)产生的多克隆抗血清能够在体外有效抑制伯氏疟原虫向动合子转化，并在体内抑制卵囊的发育(Blagboroughetal.，2009)。针对在小麦胚芽无细胞表达系统中表达的重组蛋白PfHAP2(对应于PbHAP2片段)产生的多克隆抗血清在SMFA中也显示出高TRA水平(Miuraetal.，2013)。最近，在PbHAP2和PfHAP2的结构域II中鉴定出cd融合环，并且针对与载体蛋白耦连后的cd环的抗体在体外显示出对动合子转化和按蚊传播的有效抑制(Angrisanoetal.，2017)。 HAP2是II类融合蛋白，雌雄配子识别结合的过程，因此抗HAP2抗血清抑制动合子形成可能是通过影响受精过程中膜融合导致的。针对HAP2的抗体也可能通过形成空间障碍而阻止雌、雄配子相互作用。在本实验中通过大肠杆菌原核表达系统表达了间日疟原虫aa 231-459 之间的蛋白。用镍柱纯化重组蛋白后免疫小鼠并纯化得到IgG。IFA研究发现，抗PvHAP2抗体可以有效的识别间日疟的雄性配子体。同时，在标准膜饲实验中发现其具有TRA效应，但是阻断效果不如前期已发表的杆状病毒表达蛋白免疫得到的抗体明显。本研究中，抗原核表达蛋白PvHAP2抗体使按蚊感染率降低了25%，平均卵囊数降低了15.3%。抗杆状病毒表达蛋白获得的PvHAP2抗体使按蚊感染率降低了50%，平均卵囊数降低了59.07%。我们推测可能原因是由于原核表达系统表达的重组蛋白未能折叠出完全有效的空间结构，蛋白表达后修饰不足所导致。疟原虫基因组特征是阻碍疟原虫蛋白表达的主要原因，包括：(1)疟原虫基因组中腺嘌呤和胸腺嘧啶的含量比较高；(2)疟原虫具有独特的翻译后修饰。虽然间日疟原虫基因组在许多方面与恶性疟原虫相似，但间日疟原虫在端粒—远端区域富含GC，这些原因导致大肠杆菌转录效率低下，使得疟原虫蛋白在非天然宿主中的异源表达存在蛋白折叠错误的可能性。

本实验所表达PvHAP2片段包含aa 231-459两个结构域，但是不包括cd环区域。通过对不同区域表达的蛋白进行研究，可以筛选出更有优势的候选抗原表位。在本实验中研究发现rPvHAP2具有较好的免疫原性，能够有效识别出间日疟原虫的雄性配子体。但受制于低效的蛋白表达系统，所得到的抗体传播阻断效果不佳。