PD-1在旋毛虫感染所致小鼠小肠与骨骼肌组织病理学改变中的作用*

杜素琴 祝 幸 于 艳 刘祎琪 黄京京 诸欣平 程喻力

(首都医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室，北京100069)

在蠕虫与宿主共进化历程中，蠕虫通过诱导宿主免疫细胞膜表面表达一些具有负调节作用的抑制性受体以调节宿主免疫反应。宿主因感染所致的这些抑制性受体的表达，一方面利于蠕虫在宿主体内的长期生存，另一方面通过限制过度活化的免疫反应而对感染所致炎性损伤具有一定保护作用(Wammesetal., 2016)。其中，程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)作为CD28家族分子之一，是一种重要的抑制性跨膜蛋白，可表达于活化的T细胞、B细胞和单核/巨噬细胞，通过与其配体PD-L1或PD-L2结合，在慢性感染中发挥重要免疫调节作用(Bucktroutetal., 2018)。

旋毛形线虫(Trichinellaspiralis，T.spiralis)简称旋毛虫，是一种组织内寄生的蠕虫，由该虫引起的旋毛虫病(trichinellosis)是一种常见的食源性人兽共患寄生虫病，严重危害人类健康和畜牧业生产(Rawlaetal., 2020)。旋毛虫感染可分为肠道期和肌肉期，在感染的不同时期，成虫和幼虫分别侵入不同组织所致的免疫病理损伤是旋毛虫致病的主要因素。肠道期主要发生在感染后第1周，因成虫和新生幼虫侵入肠粘膜引起十二指肠和空肠的广泛炎症；肌肉期主要发生在感染3周后，因新生幼虫随血液和淋巴移行至骨骼肌严重破坏肌纤维，并引起寄生局部炎性细胞浸润及纤维组织增生(Wilsonetal., 2015)。目前，PD-1在旋毛虫感染所致宿主组织免疫病理损伤中的免疫调节作用尚不清楚。本研究利用PD-1基因缺失(PD-1-/-)小鼠，观察PD-1缺失对旋毛虫感染肠道期和肌肉期组织病理学改变的影响，为阐明PD-1在旋毛虫感染所致宿主组织病理损伤中的调节作用提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及虫株

实验动物：SPF级野生型(wild type，WT) C57BL/6小鼠(雄性，6～8周龄)，购自北京维通利华有限公司。SPF级C57BL/6遗传背景 PD-1-/-小鼠 (雄性，6～8周龄)，购自美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)。旋毛虫虫株：源自本实验室 ICR小鼠传代保种的黑龙江猪源旋毛虫 (ISS 533)。

1.2 实验分组及动物感染

将C57BL/6小鼠随机分为4组：WT未感染组、WT感染组(WT+TS)、PD-1-/-未感染组(KO)、PD-1-/-感染组(KO+TS)。另取旋毛虫感染ICR保种小鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，去除小鼠的头部、皮毛和内脏、脂肪，分离出剩余肌肉后，用胃蛋白酶消化法消化，收集肌幼虫，并混悬于4%明胶，定量计数后，以400条肌幼虫/鼠经口灌胃感染各组小鼠。

1.3 组织病理学观察

1.3.1肠组织病理学观察: 于感染后第6 d(肠型期)处死小鼠，沿胃幽门下剪取小肠上段肠组织约1 cm；将上述组织置10%中性甲醛固定24～48 h后，脱水、浸蜡、包埋，制作4 μm厚切片，脱蜡后用苏木精—伊红染色(HE染色)，脱水封片，显微镜下观察。利用全自动切片扫描仪扫描切片，Case Viewer软件随机选择3个以上相同大小的视野，计算炎性细胞数/组织面积(cells/mm2)及肠绒毛长度/隐窝长度的比值(crypts length/villi length，V/C)，求平均值。

1.3.2肌组织病理学观察: 于感染后第28 d(肌型期)、42和60 d处死小鼠，解剖剪取小鼠膈肌。制作石蜡切片方法同上。分别进行HE染色(感染后第28、42和60 d)和Masson染色(第60 d)，显微镜下观察。利用全自动切片扫描仪扫描切片，Case Viewer软件随机选择3个以上相同大小的视野，用image pro plus6软件来计数HE染色切片中炎性细胞，按炎性细胞数/组织面积(cells/mm2)求平均值；用StrataQuest v.6软件来统计Masson染色切片中每个囊胞周围组织纤维化面积。

1.4 统计学分析

以上数据分析采用SPSS17. 0软件进行单因素检验分析，数据用均数±标准误表示，且来源于3次独立实验，*P< 0.05；**P< 0.01；***P< 0.001，且P< 0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1对旋毛虫感染小鼠肠组织病理学改变的影响

为研究PD-1在旋毛虫感染肠型期组织病理学改变中的作用，于感染后第6 d对比观察 WT小鼠和PD-1-/-小鼠小肠组织病理学改变。小肠石蜡切片HE染色结果显示，与未感染组相比，旋毛虫感染WT小鼠及PD-1-/-小鼠均表现为小肠肠绒毛缩短、糜烂，肠隐窝加深，且肠绒毛长度/隐窝的长度(V/C)的比值均明显降低(P<0.001)，但WT感染小鼠与PD-1-/-感染小鼠两组之间V/C比值无明显差异(P>0.05)；另外，WT感染小鼠及PD-1-/-感染小鼠粘膜及粘膜下层均有大量炎性细胞浸润，黏膜损伤加重，并伴有水肿，但两组之间肠组织浸润炎性细胞数量无明显差异(P> 0.05)(图1，箭头所指为炎性细胞)。该结果表明，PD-1缺失对旋毛虫感染小鼠肠型期组织病理学改变无明显的影响。

图1 旋毛虫感染小鼠肠组织切片HE染色Fig.1 Intestinal tissue sections of mice infected with T. spiralis(HE staining)Control: 未感染组；Infection: 感染组；WT：WT未感染组；KO：PD-1-/-未感染组；WT+TS：WT感染组；KO+TS: PD-1-/-感染组。A：肠道HE染色；B：肠绒毛长度/肠隐窝深度的比值(V/C)；C：肠组织粘膜及粘膜下层炎性细胞的浸润。数据用均数±标准差表示，* P< 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：表示差异无统计学意义。Control：Non-infected group; Infection：Infected group; WT：Non-infected WT mice； KO： Non-infected PD-1-/- mice；WT+TS：WT mice infected with T. spiralis；KO+TS：PD-1-/- mice infected with T. spiralis. A：HE staining of intestinal; B：Ratio of intestinal villi length (V) to intestinal recess length (C); C：Inflammatory cells into the mucosa and submucosa of intestinal tissue. Value represent mean ± SD, * P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：Not significant．

2.2 PD-1对旋毛虫感染小鼠肌肉组织病理学改变的影响

为研究PD-1在旋毛虫感染肌型期组织病理学改变中的作用，分别于感染后第28、42和60 d通过HE染色对比观察旋毛虫感染WT小鼠和PD-1-/-小鼠肌幼虫囊包周围肌组织病理学改变，于感染后第60 d通过Masson染色观察囊包周围组织纤维化水平。HE染色结果显示，未感染WT小鼠和PD-1-/-小鼠肌纤维正常、排列整齐，横纹较清晰；而WT感染小鼠肌肉组织中幼虫囊包周围部分肌纤维肿胀、排列紊乱、横纹有不同程度的消失，且间质有轻度水肿和不同程度的炎性细胞浸润，感染后第28 d幼虫囊包周围浸润的炎性细胞数量较高，随感染时间的延长，炎性细胞浸润数量逐渐下降。PD-1-/-感染小鼠肌肉组织中幼虫囊包周围肌纤维肿胀程度较WT感染小鼠更为严重，排列明显紊乱，且部分肌纤维甚至发生断裂，幼虫囊包周围炎性细胞浸润数量在各时间点均明显高于WT小鼠(P< 0.05)。另外，PD-1-/-感染小鼠单位视野中肌幼虫囊包数量明显多于WT小鼠(图2)。该结果表明，PD-1缺失可促进幼虫在肌组织的寄生，并促进肌组织中幼虫寄生所致的炎性细胞浸润，加重肌肉炎性损伤。Masson染色结果显示，未感染WT小鼠和PD-1-/-小鼠肌组织无纤维化。旋毛虫感染第60d，PD-1-/-小鼠每囊包周围肌组织纤维化面积均值明显小于WT小鼠，表明PD-1缺失能抑制幼虫囊包周围肌组织纤维化(图3)。

图2 旋毛虫感染小鼠膈肌组织切片HE染色Fig.2 The diaphragmatic tissue sections of mice infected with T. spiralis(HE staining)A：膈肌组织切片HE染色，感染后第0、28、42、60 d(0day、28day、42day、60day)；B：膈肌组织囊包周围炎性细胞的浸润数量；C：每个视野的囊包数。数据用均数±标准差表示，* P< 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：表示差异无统计学意义，下同。A：H&E staining of diaphragm tissue sections, 0, 28, 42, and 60 days after infection (0day, 28day, 42day, 60day)；B：The number of inflammatory cells around the cysts；C：Number of follicles per field. Value represent mean ± SD, * P<0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：Not significant. The same below.

图3 旋毛虫感染小鼠膈肌组织切片Masson染色Fig.3 The diaphragmatic tissue of mice infected with T. spiralis(Masson staining)A：感染后60 d小鼠膈肌组织切片Masson染色情况；B：每个囊包周围组织蓝色区域面积。A：Masson staining of diaphragmatic muscle tissue of mice 60 days after infection；B：The blue area around per cyst(Total blue area/cysts).

3 讨论

在慢性感染过程中，病原体诱导宿主抑制性共刺激分子的表达对于维持机体免疫平衡具有重要作用。PD-1作为一种重要的抑制性分子对病原体感染所致免疫病理反应具有调节作用(Karunarathneetal., 2016; Hoogeveenetal., 2019)。已有研究报道，PD-1介导的免疫调节作用能抑制蠕虫感染所致的病理性免疫反应的发生发展。例如，在血吸虫慢性感染小鼠模型中利用抗体阻断PD-1信号可增强虫卵所致的肝脏免疫病理反应(Zhouetal., 2016)；利用PD-L2基因缺失小鼠建立慢性肝片形吸虫感染小鼠模型发现，阻断PD-1/PD-L2信号可加重肝脏的炎性损伤(Stempinetal., 2016)。然而，不同虫种经PD-1调节宿主免疫病理反应的机制不尽一致。

在旋毛虫感染肠型期，由于脱囊幼虫与雌成虫侵入肠黏膜，加之虫体排泄分泌物及产出的大量新生幼虫的刺激，导致肠绒毛缩短，隐窝加深，黏膜下层伴有大量炎性细胞浸润(Zhuetal., 2018)。本研究结果与之相一致，WT组小鼠在感染后肠组织V/C比值降低，且表现为明显的炎症反应。而旋毛虫感染PD-1-/-小鼠的V/C比值及小肠组织炎症细胞浸润数量较WT小鼠均无显著差异，提示PD-1对旋毛虫感染小鼠肠型期肠组织病理学改变无明显影响。在旋毛虫感染肌型期，幼虫移行至横纹肌后，导致肌纤维严重破坏以及肌组织中幼虫囊包的形成，这种特异性的病理变化是宿主抗旋毛虫免疫反应的结果(Renetal., 2018)。本研究通过HE染色动态观察WT小鼠旋毛虫感染后28～60 d小鼠膈肌组织病理学变化，结果显示感染第28 d炎性细胞浸润数量最多，而随感染时间的延长肌组织囊包幼虫周围的炎性细胞浸润逐渐减少。感染第60 d Masson染色结果显示，囊包周围肌组织出现明显的纤维化囊壁，提示肌膜周围纤维结缔组织发生增生修复。而PD-1-/-感染小鼠肌组织中囊包数及炎性细胞浸润数量在感染后各时间点均明显高于WT小鼠，而单个囊包周围纤维化面积均值明显低于WT小鼠，提示PD-1介导的免疫调节作用能抑制幼虫在肌组织的寄生及其所致的免疫病理反应，并在感染后期促进了幼虫囊包周围组织的纤维化。上述结果证实PD-1在旋毛虫感染免疫中具有一定免疫保护作用。早期研究认为，PD-1主要表达于活化的T细胞表面，通过与抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)膜表面相应的配体PD-L结合而向T细胞传递抑制性信号，导致效应T细胞失活，且增殖受限，从而发挥免疫负调节作用(Bishopetal., 2009; Chikumaetal., 2009; Franciscoetal., 2009)。近年研究表明，PD-1/PD-L信号通路对病原诱导宿主的免疫反应类型也具有一定调节作用。已有研究证实，PD-1可促进蠕虫感染所致的Th2型免疫反应(van der Werfetal., 2013; Schwartzetal., 2017; Wangetal., 2018)。我们前期利用PD-1-/-小鼠研究发现，PD-1缺失条件下旋毛虫诱导小鼠CD4+T细胞向Th2细胞分化的作用显著下降(Chengetal., 2018)。由于蠕虫诱导宿主产生的2型免疫反应一方面发挥抗虫免疫保护作用，另一方面对感染所致宿主的免疫病理损伤具有限制和修复作用(Gauseetal., 2013)，据此，我们推测PD-1-/-小鼠较WT小鼠肌幼虫囊包数显著增多、肌组织炎症反应的加重以及纤维化水平的下降可能与Th2型免疫反应水平的下降有关。然而，本研究发现PD-1-/-和WT小鼠肠组织病理改变无明显区别，这可能与感染早期WT小鼠和PD-1-/-小鼠Th2型免疫反应尚无明显差异有关。

综上所述，本研究证实PD-1对旋毛虫感染肠型期组织病理学改变无明显影响，但对肌型期幼虫生存及肌组织炎症反应具有一定抑制作用，而旋毛虫经PD-1抑制旋毛虫感染肌幼虫所致组织病理学改变的免疫学机制有待进一步证实。