四黄止痢复方中药纳米乳的制备及其质量评价

郑晓婷，蒋 红，王宏军

（锦州医科大学，辽宁锦州121001）

四黄止痢复方中药组方中以黄连、黄芩为主药，黄连泻心火兼泻中焦火，黄芩泻肺火于上焦；辅以大黄泄热通肠，清除胃肠湿热积滞，且板蓝根清热解毒，并助主药解热，为辅药；黄檗泻肾火于下焦为佐药；甘草清热解毒，诸药合用具有清热解毒、涩肠止泻之功效[1]。主治大肠杆菌类疾病，同时还可有效预防和治疗鸭疫里莫氏杆菌、仔猪黄白痢、流行性、细菌性、湿热性腹泻的防治，还可用于种蛋消毒[2-4]。纳米药物是纳米技术与药学相结合后研发的一种新剂型。纳米制剂与其他剂型比较来说其粒径更小、比表面积更大、表面反应活性更高、活性中心更多。纳米制剂可以有效提高中药的溶解度，提升生物利用度，提升药物疗效，起到缓释控释作用和靶向作用。纳米制剂可以在保证药效的同时降低毒性、副作用以及减少用药量[5]。文章旨在研究制备四黄止痢复方中药纳米乳，并对其质量进行评价。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、78-1 磁力加热搅拌器（江苏省金坛市宏华仪器厂）、HC-1000V 型粉碎机（永康市天琪盛世工贸有限公司）、0.22 μm 微孔过滤膜（锦州市众源实验经销处）、上海雷磁PHS-3C 台式酸度计（上海雷磁仪器有限公司）、恒温培养箱（北京金北德工公司）。

1.2 试验材料

大黄提取物（西安瑞林生物科技有限公司）、黄芩提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、黄连提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、黄檗提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、板蓝根提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、甘草提取物（西安瑞盈生物科技有限公司）、IPM（上海麦克林生化科技有限公司）、油酸乙酯（济南汇锦川商贸有限公司）、聚氧乙烯40 蓖麻油（山东信恒化工有限公司）、聚乙二醇（天津市东丽区天大化学试剂厂）、聚山梨醇酯（天津福晨化学试剂有限公司）、1，2 丙二醇（天津市标准科技有限公司）、丙三醇（天津福晨化学试剂有限公司）、吐温80（天津福晨化学试剂有限公司）、苏丹红Ⅲ（上海瀚思化工有限公司）、亚甲蓝（上海瀚思化工有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 绘制伪三元相图

按油相、水相、表面活性剂与助表面活性剂混合相在临界点是其各自的质量百分数，用等边三角形的三条边分别表示水相、油相以及表面活性剂与助表面活性剂混合相[6]，用Origin 8.5 软件绘制该纳米乳的伪三元相图，筛选出最优处方。

1.3.2 处方的选择

1.3.2.1 油相的选择

纳米乳中使用的油应与表面活性剂保持互相作用，而且易于成膜[7]。油相链越短，油相越易渗透到膜中，碳氢链越长的油相，则会提高药物的溶解度。本试验待选油相有肉豆蔻酸异丙酯（IPM）、大豆油、油酸乙酯、橄榄油。

1.3.2.2 表面活性剂的选择

表面活性剂可根据亲水亲油平衡（HLB）值进行筛选，HLB值在3～8的乳化剂可制备成W/O型纳米乳，HLB值在8～16 的乳化剂可制备O/W 型纳米乳[8]。本试验待选表面活性剂和HLB 值均大于7，分别为吐温80、聚氧乙烯蓖麻油（RH40）、聚山梨醇酯、泊洛沙姆（HLB 值高于20 的通常作为助表面活性剂来调节总体HLB值，以求达到纳米乳制备所需的条件）。

1.3.2.3 助表面活性剂的选择

助表面活性剂在纳米乳的形成过程中可以协调降低水相、油相的表面张力，增加表面活性剂的溶解度[9]，一般选择中链、短链醇。本试验以聚乙二醇、1，2 丙二醇、无水乙醇、丙三醇作为助表面活性剂。

1.3.2.4 表面活性剂和助表面活性剂质量比（Km）的确定

将表面活性剂吐温80、助表面活性剂丙三醇、油相IPM混合成乳，分别选择Km值为0.5、1、2、3制作伪三元相图，观察图中成乳区域面积的大小、乳化颗粒在乳液中的性质、乳化程度及体系稳定性，来确定最佳Km值。

1.3.2.5 含药纳米乳的制备

精确称量IPM、吐温80、丙三醇、水于烧杯中，室温下借助磁力搅拌机搅拌至澄清即得空白纳米乳。分多次少量将四黄止痢提取物（ECCS）加入制备好的空白纳米乳中，观察ECCS的用量。

1.3.3 质量评价

1.3.3.1 纳米乳的评价标准

肉眼观察外观形态，平行光照射，乳滴粒径检测。

1.3.3.2 鉴别试验取两份2～3 mL 四黄止痢纳米乳（ECCS-NE）分别加入2 支试管中，再分别向2 支试管中加入苏丹红Ⅲ和甲基蓝溶液1～2滴，观察到红、蓝两溶液的扩散速度快，若苏丹红Ⅲ溶液扩散比甲基蓝扩散快，则ECCS-NE 为W/O 型。若甲基蓝溶液扩散的比苏丹红Ⅲ溶液扩散快，则ECCSNE为O/W型[10]。

1.3.3.3 粒径分布及Zeta电位

送至北京中科百测负染电镜观察纳米乳形态。

1.3.3.4 pH值

取l0 mL ECCS-NE，置于烧杯中，用pHS-3C 型精密酸度计测定pH值。

1.3.4 稳定性

1.3.4.1 光照试验

根据《中国药典》2015版，将3组不同批次制备的纳米乳置于4000～5000 lux 强度下进行光照，分别于0、5、10 d观察纳米乳外观状态、pH值。

1.3.4.2 温度试验

根据《中国药典》2015 版，将3 组不同批次制备的9 管纳米乳于25、50、70 ℃，相同湿度下放置，分别于0、5、10 d时观察纳米乳状态。

1.3.4.3 湿度试验

将3 组不同批次制备的6 管纳米乳于70%、90%湿度于密闭容器室温放置，分别于0、5、10 d 时观察纳米乳状态。

1.3.4.4 离心试验

高速离心可有效评价纳米乳体系的稳定性，取5 mL ECCS-NE 于离心管中，在室温下10000 r/min 离心25 min，观察样品状态。

1.3.4.5 静置试验

取一定量的样品于密闭容器25 ℃放置0、10、30、60 d。

1.3.5 包封率和载药量

量取制备的ECCS-NE10 mL，加甲醇在25 mL容量瓶中定容，超声10 min，吸取1 mL加甲醇于5 mL容量瓶中定容。0.22 μm微孔过滤膜滤过待检，所得药物含量W1，3次平行试验。再次量取制备的ECCS-NE 5 mL，加37 ℃的纯水在10 mL 容量瓶中定容，摇匀，量取3 mL，置离心管10000 r/min离心20 min，精密量取上清液1 mL，加入适量甲醇混匀，超声助溶10 min，待其冷却到室温。0.22 μm微孔过滤膜滤过待检，所得药物含量W2，3 次平行试验。按已有公式得出载药量及包封率[11]。

2 结果与分析

2.1 处方的选择

2.1.1 油相的选择

根据2015版兽药典标准，称取10 mL四黄止痢复方中药溶液置于室温下滴加在10 mL备选油相中，边滴加边振荡至饱和，静止5 min 后振荡30 s，观察30 min 内溶解情况，平行测定3次结果显示，ECCS溶液在IPM中溶解度最大。因此，选择IPM为油相。

2.1.2 表面活性剂的选择

聚山梨醇酯、聚氧乙烯40蓖麻油所形成的纳米乳体系放置一段时间后体系浑浊。伪三元相图法绘制吐温80、泊洛沙姆体系的伪三元相图。结果表明，吐温80作为表面活性剂时成乳区域更大，因此确定吐温80为表面活性剂。

2.1.3 助表面活性剂的选择

聚乙二醇、1，2 丙二醇、无水乙醇、丙三醇与表面活性剂Tween 80 混合后；按照不同的质量比与油相混合，滴加水相，均可形成纳米乳体系。但无水乙醇放置后挥发体积减小、1，2丙二醇出现浑浊。伪三元相图法绘制聚乙二醇、丙三醇体系的伪三元相图，确定以丙三醇为助表面活性剂。

2.1.4 Km值的确定（见图1）

图1 不同Km值所绘制的伪三元相图Fig.1 Pseudo ternary phase diagram drawn by different Km values

Km 是决定纳米乳形成的重要条件[12]，分别以Km=0.5、Km=1、Km=2、Km=3，油相为IPM、表面活性剂为吐温80、助表面活性剂为丙三醇，以“1.3.1”项方法绘制伪三元相图。由图1 可知，纳米乳成乳面积为Km=2＞Km=0.5＞Km=1＞Km=3，因此筛选出Km值为2。

2.1.5 处方筛选结果

以四黄止痢复方中药为原料药，IPM 为油相，吐温80为表面活性剂，丙三醇为助表面活性剂制成复方纳米乳，乳液黄色澄清透明、无沉淀、无分层、性质稳定。油相与表面活性剂比为1∶4，Km 值为2∶1，所制备的纳米乳粒子的粒径大小等各方面均最稳定。

2.2 含药纳米乳的制备

精确量取吐温804 mL、丙三醇2 mL，置于50 mL烧杯中，在磁力搅拌器的作用下，37 ℃恒温搅拌，缓慢滴加1 mL IPM，继续在37 ℃的恒温磁力搅拌器下进行混匀，加入20 mL蒸馏水，在上述条件下继续混匀，加入ECCS搅拌至完全溶解，得澄清透明的四黄止痢复方中药纳米乳制剂。

2.3 四黄止痢复方中药纳米乳的评价

2.3.1 外观形态观察及乳液类型

外观呈透明或者半透明状态；且有乳光；10000 r/min离心25 min，乳液稳定无分层或絮凝现象；平行光照射后出现丁达尔现象，可观察到亚甲基蓝的扩散速度较苏丹红Ⅲ扩散快，判断ECCS-NE为O/W型。

2.3.2 粒径分布及Zeta电位（见图2）

图2 纳米乳透射电子显微镜照片Fig.2 Transmission electron microscope photo of nanoemulsion

由图2 可知，纳米乳颗粒是分布均匀的圆球形且大小基本一致，ECCS-NE 的粒径为（45.06±2.47）nm，ECCSNE的Zeta电位为-6.11 mV。

2.3.3 pH值检测结果（见表1）

由表1可知，pH值的平均值为6.94，该制剂偏酸性。

表1 pH值检测结果Tab.1 pH value test results

2.4 稳定性

ECCS-NE 分别采用光照射试验、温度试验、湿度试验、离心试验、常温静置，试验仍黄色澄清液体、无沉淀、无水油分层。

2.5 包封率和载药量（见表2）

表2 包封率及载药量检测结果Tab.4 Test results of encapsulation efficiency and drug loading 单位：%

由表2 可知，该制剂的包封率为0.727，载药量为84.8%。

3 讨论

药物的首过效应使动物口服药物时效力降低，患禽用药采取混水混饲方式时，导致药物摄入量不均。因此，本试验将四黄止痢复方中药制成纳米乳剂，借助纳米剂的控释、缓释可提高药物在体内停留时间，提高生物利用度。

油相、表面活性剂、助表面活性剂均应选择对本试验所用药物溶解度大、无毒、无刺激，因而本试验选用IPM、丙三醇、吐温80、蒸馏水为成乳系统。备选油相中IPM 对四黄止痢复方中药溶解度最大；选取吐温80作为表面活性剂时成乳区最大；助表面活性剂常选用醇类来协助调解HLB 值和增加药物溶解度，使其形成更稳定的纳米粒子，因此选用丙三醇作为助表面活性剂。但是，醇类是挥发性的[13]。因此，必须将其密封存放，否则会引起药物沉淀并影响纳米乳剂的质量。

4 结论

通过绘制伪三元相图的方法来确定四黄止痢复方中药纳米乳的最适制备工艺，并对其进行质检，且稳定性良好。