腊梅花精油的GC-MS分析及抗炎作用研究

戴文敬，罗 超，余惠凡，赵万红

(1. 湖北医药学院基础医学院，湖北十堰 442000)

腊梅系腊梅科腊梅属植物，腊梅花药用价值和保健价值很高，并且安全无毒，可食用，其香气独特。李时珍在《本草纲目》中说：“腊梅花味甘、微苦，采花炸熟，水浸淘净，油盐调食”，既是味道颇佳的食品，又能解热生津[1]。现代药理学研究表明，腊梅属植物具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂、抗癌等作用[2-5]。腊梅花提取物可显著增强大鼠巨噬细胞的吞噬活性和体液免疫功能[6]。腊梅根部(铁筷子)醇提物可以有效抑制佐剂性关节炎大鼠的关节肿胀，并发现这可能与血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血小板活化因子(PAF)水平的降低有关[7]。

已有文献对重庆北碚区的腊梅花精油进行GC-MS分析[8]，但对十堰地区腊梅花精油成分的分析还未见报道。本研究所用的腊梅花精油是由湖北巴山食品有限公司与西南大学联合制备，利用超临界CO2萃取(supercritical fluid CO2extraction, SFE-CO2)、膜分离浓缩等技术提取制备，保留了腊梅花大部分的活性成分。本研究对腊梅花精油成分进行GC-MS分析，并基于动物实验对其抗炎作用进行初步研究，为腊梅花资源的开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant, FCA)购自美国SIGMA公司，生产批号SLBW7430；阿司匹林泡腾片购自阿斯利康制药有限公司，生产批号1710001；大鼠白介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒(生产批号CQN8FWKD7M)及大鼠TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(生产批号DRHY7MQPPF)均购自Elabscience公司；其他试剂均为国产分析纯。GCMS-TQ8040型三重四极气质联用仪购自岛津企业管理(中国)有限公司；C18小柱，Sep-Pak Vac 35cc(10 g)(零件号WAT043345，批号042238171A)、固相萃取装置(型号FB65453，序号152601)购自Fisher Scientific公司。

1.2 实验动物SD大鼠购自湖北医药学院实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2016-0008，实验动物使用许可证号SYXK(鄂)2016-0031，并饲养于湖北医药学院实验动物中心，自由摄食和饮水，室内温度25 ℃左右，相对湿度为60%～70%。SPF级SD大鼠，体质量(200±20)g。本研究所涉及的动物实验相关操作均已通过动物伦理委员会的批准。

1.3 GS-MS分析

1.3.1腊梅花精油及处理腊梅花精油(由湖北巴山食品有限公司提供，8%水溶性提取物，含水量92%左右，每毫升精油提取自25.4 g鲜花，相对密度0.994，pH 3.5～4.2，透光率90%～95%)。将腊梅花精油样品利用固相萃取，C18小柱浓缩，甲醇洗脱后，得到一种黄色具有腊梅花自然香气的液体。用甲醇稀释后过滤、离心，加入气相色谱样品瓶中。

1.3.2气相色谱条件色谱柱：Rtx-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。程序升温条件：初始温度40 ℃，保持5.0 min，以3 ℃/min的速率升至250 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min的速率升至300 ℃，保持3 min；柱箱温度40 ℃；进样口温度250 ℃；进样模式为分流；压力49.5 kPa；总流量26.0 mL/min；柱流量1.00 mL/min；线速度36.1 cm/s；吹扫流量5.0 mL/min ； 分流比20.0 ； 载气为氦气 ； 进样量1 μL。

质谱条件如下：电离方式为EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，溶剂延迟4.5 min，ACQ方式Scan，扫描速度769 amu/s，扫描范围40～400 amu。

1.4 造模[9]及分组SPF级SD大鼠72只，随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(阿司匹林200 mg/kg)及腊梅花精油低、中、高剂量组(0.1、0.3、0.8 g/kg)。阳性对照组给予阿司匹林灌胃处理，腊梅花精油低、中、高剂量组分别给予0.1、0.3、0.8 g/kg腊梅花精油10 mL/kg灌胃处理，空白对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃处理，每日1次。于第5天灌胃后30 min，对各组大鼠右侧足跖皮下注射FCA 0.1 mL，空白对照组给予生理盐水0.1 mL。观察并用排水法[10]测量致炎前及致炎后1、2、3、5、24、48、72 h大鼠足趾体积，计算各时间点大鼠足趾肿胀率。肿胀率=(致炎后各时间点足容积-致炎前足容积)/致炎前足容积×100%。

1.5 足部肿胀组织炎症因子的检测致炎后72 h，将大鼠麻醉后处死，分别取下致炎侧足部肿胀组织，用冰PBS清洗、称重后将组织剪碎，液氮中快速充分研磨至粉末状，加入对应体积的PBS，超声进一步粉碎， 离心后取上清，按照ELISA试剂盒操作说明检测肿胀组织中TNF-α和IL-1β的含量。

1.6 足部肿胀组织病理学观察致炎后72 h，将大鼠麻醉后灌流，剪下致炎侧足趾，小心取下肿胀组织进行固定，脱水、石蜡包埋、切片，染色后镜下观察。

1.7 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料均以均数±标准差表示。经正态性检验及方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和重复测量资料的方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 腊梅花精油化学成分的GS-MS鉴定情况通过GC-MS联用仪，将腊梅花精油按照1.3.2项中的GC-MS分析条件进行鉴定，通过仪器自带的NIST08s.LIB和NIST08.LIB谱图库检索，再结合有关文献资料，并按照峰面积归一法进行定量分析，计算出了精油中各种成分的相对含量。最终确定从超临界CO2萃取的腊梅花精油中共鉴定出48种香气成分，其中，醇类25 种(占64.42%)、酯类4 种(占9.27%)、醛类2种(占11.62%)，其他类17种(占13.06%)；相对含量在1%以上的成分有18种，占总含量的83.86%(表1)，由此构成腊梅花香气的主要成分(图1、表1)。

图1 GC-MS联用仪检测超临界CO2萃取腊梅花精油的总离子流图

表1 超临界CO2萃取腊梅花精油的GC-MS分析结果

续表1

2.2 对FCA致足趾肿胀的影响与空白对照组相比，模型组和腊梅花精油低、中、高剂量组及阳性对照组在注射FCA后足趾肿胀率均升高，在注射FCA后72 h肿胀率达最高；与模型组相比，腊梅花精油低剂量组在注射FCA后仅5、48 h时对大鼠足趾肿胀有明显抑制作用，而腊梅花精油中剂量组在注射FCA后1、3、5、24、48 h时对大鼠足趾肿胀均有明显抑制作用，腊梅花精油高剂量组在注射FCA后1、2、3、5、24、48 h时对大鼠足趾肿胀均有明显抑制作用(P<0.05或P<0.01，图2)。

2.3 足部肿胀组织中炎症因子的变化与空白对照组相比，模型组TNF-α、IL-1β均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，腊梅花精油3个剂量组和阳性对照组的TNF-α均明显减少，差异具有统计学意义(P<0.01，表2)。与模型组相比，腊梅花精油中、高剂量组和阳性对照组大鼠肿胀组织中IL-1β明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01，表2)。

图2 腊梅花精油对FCA所致大鼠足趾肿胀的影响

表2 腊梅花精油对FCA诱导的大鼠肿胀组织中TNF-α、IL-1β含量的影响

2.4 足部肿胀组织的病理变化空白对照组大鼠足部肿胀组织中未见明显的中性粒细胞浸润；模型组在皮下结缔组织、肌层、血管周围都有大量的炎细胞浸润，并以中性粒细胞为主；腊梅花精油低、中、高剂量组在皮下结缔组织、血管周围均有大量炎细胞浸润，但肌肉组织炎细胞浸润不明显，并且随着腊梅花精油剂量的升高，炎细胞浸润程度降低；阳性对照组在皮下结缔组织有大量炎细胞浸润，但血管周围、肌肉组织等部位浸润程度较轻(图3)。

3 讨 论

本研究应用GC-MS联用分析超临界CO2萃取所提取十堰地区腊梅花精油，共鉴定出48个香气成分，其中醇类25种(占64.42%)、酯类4种(占9.27%)、醛类2种(占11.62%)。这与文献报道的重庆北碚区腊梅花精油的香气成分有所不同，重庆北碚区腊梅花精油共鉴定出57种香气成分[8]，两者醇类含量相当(67.30%)，且十堰地区腊梅花精油醇类种数多于重庆北碚区腊梅花精油(重庆北碚区腊梅花精油醇类17种)，这可能是因为不同的产地、气候等因素对腊梅花化学成分有一定影响。

图3 FCA致炎后72 h各组大鼠足部肿胀组织的HE染色结果

FCA在注入大鼠足部数小时后，注射侧的足部开始出现红肿，并明显肿胀而形成原发性病变。通过弗氏完全佐剂所致原发性足肿胀实验制作模型并干预[9]，发现腊梅花精油对急性炎症早期的毛细血管扩张、血管通透性增加和炎症渗出、水肿有明显抑制作用，并且其抗炎作用具有剂量依赖性。

在正常生理情况下，机体内的TNF-α、IL-1β等炎症介质主要对组织起保护作用，但在炎症过程中，免疫细胞如巨噬细胞和单核细胞等会释放大量的促炎因子，从而造成免疫系统损伤，出现红、肿、热、痛等症状[11-14]。其中，TNF-α在炎症反应过程中有重要作用，其不仅在炎症反应中出现最早，并且能够激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促进其他细胞因子的合成和释放，从而推动炎症反应的进程[15-16]。FCA皮下注射可产生局部炎症，出现发红、肿胀、发热等症状，造成TNF-α、IL-1β等的释放增加，出现足部肿胀，局部炎细胞浸润增加[17]，并在致炎后72 h其同侧脊髓组织中TNF-α的表达最高[18]。本研究检测了不同剂量的腊梅花精油对FCA致炎后72 h的大鼠足部肿胀组织中TNF-α、IL-1β含量的影响，同时通过足部病理变化观察局部炎细胞的浸润情况，结果表明，腊梅花精油各剂量组具有抗炎作用，其抗炎作用的发挥与抑制TNF-α和IL-1β的分泌有关。

综上所述，腊梅花精油对大鼠弗氏完全佐剂所致原发性病变的炎症模型具有明显抑制作用，为民间使用腊梅花以及十堰地区腊梅花资源的开发利用提供了药理学基础，但其抗炎作用的机制仍未完全阐明，有待进一步研究。本研究中所使用的腊梅花精油富集了腊梅花大部分的有效成分，但其成分比较复杂，发挥抗炎作用的具体成分，还需要进行更深入的研究。