大熊猫酶标孕酮的制备与检验

赵卫平，李 婵，洪 金，林鹏飞,*，雷颖虎,*

(1.秦岭大熊猫研究中心，陕西 周至 710402；2.西北农林科技大学)

大熊猫是我国特有珍稀动物，冠有国宝美称，尽管被划分为国家一级保护动物，其数量却仍然增长缓慢。除了人为因素的影响，这还与其独特的生理繁殖机制有关，大熊猫是单季节发情动物，发情时间短，仅有1～3 d，如何精准判断大熊猫的发情期是提升大熊猫繁殖率的最关键一步。孕酮(Progesterone，P4)和雌激素(Estrogen)做为雌性动物发情时变化最为剧烈的两种激素，且在动物尿液中就可检测到，因此可作为大熊猫无侵入损害的一个检测指标。

目前ELISA检测技术已大量应用于激素检测，HRP是ELISA试剂盒显色体系的主要成分之一，其与抗原或者抗体结合可以形成酶标抗原或酶标抗体从而应用于ELISA试剂盒中。P4为半抗原，化学结构相对稳定，不能与HRP直接结合，需要用11α-OH-P4进行化学修饰后与HRP结合，因此本试验旨在合成用于孕酮检测的ELISA试剂盒的辣根过氧化物酶酶标的P4-HRP偶联物，为后续开发大熊猫孕酮ELISA检测试剂盒提供所需的酶标抗原。

1 材料与方法

表1 试剂及耗材

1.2 主要仪器

表2 试验用仪器

1.3 方法

1.3.1 孕酮-半琥珀酸酯的合成 ①称取5 g 11α-羟基孕酮(11α-OH-P

4)、5.96 g 琥珀酸酐与2.6 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)于圆底烧瓶中，加入200 mL二氯甲烷，搅拌回流反应5 ～10 h；②薄层色谱反应(Thin layer chromatography，TLC)同时进行跟踪反应进度，展开剂为V乙酸乙酯：V石油醚=10∶1；③待反应完全后，将反应液用60 mL二氯甲烷稀释；④纯化：反应液用10 mL去离子水萃取1次，10 mL 2 M 盐酸萃取2次，最后用去离子水萃取2次；⑤干燥脱色：加入无水硫酸钠干燥，活性炭室温搅拌脱色，过滤得无色澄明液，减压蒸尽二氯甲烷，干燥得到白色结晶产物，即为11α-羟基半琥珀酸酯(11α-OH-P4-HS)。

1.3.2 11α-OH-P4-HS的鉴定 (1)11α-OH-P4-HS的TLC鉴定反应至终点时，取少量反应液，进行TLC鉴定；(2)11α-OH-P4-HS的产率鉴定产率即合成反应中实际产物的量与理论值的比值。在此合成反应中，反应物 11α-OH-P4的物质的量与合成11α-OH-P4-HS的物质的量的比值根据公式①计算：

产率= n(11α-OH-P4)/ n(11α-OH-P4-HS)× 100%

(公式①)

1.3.3 孕酮酶标抗原的制备 ①取11α-OH-P4-HS 2.6 mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.9 mg和二环己基碳二亚胺(DCC)1.3 mg置于5 mL三角烧杯中，滴加0.15 mL二甲基甲酰胺(DMF)，混匀后4 ℃过夜；②次日发现有尿素衍生物结晶析出，说明已有孕酮衍生物的NHS活化酯形成；③取HRP 2 mg，用2 mL 0.1 M NaHCO3溶解，室温下加活化酯2 μL搅拌，每10秒加2 μL，共10 μL。继续搅拌8 h，用0.04 M pH 7.2的PBS 1 000 mL搅拌透析24 h，期间换液三次。

1.3.4 酶标抗原的鉴定 (1)免疫学鉴定①包被：5 ng/mL 的P4单克隆抗体加入酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液洗3次，拍干；②封闭：每孔加封闭液200 μL，37 ℃ 2 h，弃封闭液，洗涤液洗3次，拍干；③抗原反应：11α-OH-P4、HRP以及产物，倍比稀释为1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1 600，每孔100 μL，37 ℃ 60 min，弃反应液，洗涤液洗3次，拍干；④显色：每孔加新鲜配制的底物溶液100 μL，显色10～15 min；⑤终止：每孔加终止液50 μL；⑥读数：在450 nm处测定光密度(OD)值。(2)紫外扫描鉴定将一定浓度的半抗原、载体蛋白以及偶联产物利用紫外分光光度计在200 nm-400 nm处进行扫描，通过扫描波长的变化，判断偶联是否成功。(3)酶标记率采用超微量紫外分光光度计，读取酶标复合物的 OD260 nm 值、OD280 nm值以及 OD403 nm值，根据公式分别计算酶标复合物中的酶结合量与抗原含量，计算其酶标记率。

酶结合量=OD403nm×0.42 (公式②)

抗原含量=(OD280nm-OD403nm×0.42) ×0.94×0.62 (公式③)酶标记率=P4-HRP中的酶量(mg) /加入的HRP酶量(mg)×100%(公式④)

2 结果

2.1 孕酮-半琥伯酸酯的鉴定

2.1.1 孕酮-半琥珀酸酯的 TLC 鉴定 由于11α-OH-P4和11α-OH-P4-HS分子结构的差异，二者极性也存在差异。本研究中，11α-OH-P4-HS在展开剂中的吸附性较强，而11α-OH-P4的吸附性较弱，因此，移动距离大的点为11α-OH-P4与副反应产物，移动距离小的点为11α-OH-P4-HS，鉴定结果如图1所示，该反应已完全。

图1 薄层色谱鉴定

2.1.2 孕酮-半琥珀酸酯的合成产率 根据公式①计算可得，11α-OH-P4-HS的产率为78.64%。

2.2 酶标抗原的鉴定

2.2.1 酶标抗原紫外扫描鉴定 紫外扫描鉴定见图2，P4-HS、HRP以及产物三者的紫外扫描图差异较大，产物紫外扫描于HRP、P4-HS均有不同。反应中小分子物质经透析已去除，因此推测产物为HRP偶联物。

图2 紫外扫描鉴定结果

2.2.2 免疫学鉴定 免疫学鉴定如图3所示，产物随稀释倍数增大，其OD值减小，HRP和P4-HS的OD值基本不随浓度变化而改变。结果表明，产物与P4单克隆抗体发生特异性反应，而HRP、P4-HS不会与之发生反应，即产物对P4单克隆抗体具有免疫学特性，HRP、P4-HS对P4单克隆抗体不具有免疫学特性。结合图3结果，产物为HRP的偶联物，HRP的偶联物与P4单克隆抗体具有免疫学特性，则推测该偶联物为P4-HRP。

图3 免疫学鉴定结果

2.2.3 酶标记率 经过超微量紫外分光光度计检测酶标复合物的 OD280nm 与 OD403nm 值，吸光度值分别为1.325、2.726，酶结合量1.145，其中抗原含量0.105，酶标记率22.9%。

3 讨论

11α-OH-P4官能团为稳定的羟基，不能直接与HRP结合，需要先将羟基通过DMAP催化，变为较为活泼的酯基，即11α-OH-P4-HS，再用偶联了琥珀酸酐的11α-OH-P4-HS进行试验偶联。羧基可以通过碳二亚胺与HRP中赖氨酸的氨基偶联，形成酶标抗原。

碳二亚胺法合成完全抗原时，HRP中赖氨酸数量对酶标记率起决定作用。运用碳二亚胺法合成偶联物，碳二亚胺(DCC、EDC)为中间物，活化11α-OH-P4-HS的羧基，在NHS的催化下，与HRP上的赖氨酸中氨基形成酰胺键偶联，因此一个HRP上可以偶联多个11α-OH-P4-HS，综上，在碳化二亚胺反应中，11α-OH-P4-HS加入量应略微过量。

在反应中，过量的11α-OH-P4-HS以及碳二亚胺DCC、EDC和催化物NHS，均可能以不同的化学形态存在于终产物中，因此终产物中的很多副产物须进行纯化去除。常用的纯化方法有透析和凝胶层析两种，由于透析法较凝胶层析法简单、易操作、可行性强，因此本研究选择透析纯化法。为取得较高保留率，本试验选用8 000-14 000分子密度的透析袋，截留分子量值约为保留的大分子值的一半，且实验中小分子值远小于最小保留量8 000；试验中除偶联物与载体蛋白外，其它都是小分子物质，因此终产物仅有蛋白以及蛋白偶联物。

本试验目的是制备用于ELISA试剂盒的P4-HRP，因此在鉴定制备是否成功时，首先选择免疫学检验，通过倍比稀释P4-HRP，使其与相应抗体反应，同时用11α-OH-P4和HRP做对照，检测P4-HRP与P4抗体反应灵敏度。理论上11α-OH-P4与对应应一抗也存在特异性反应，但本试验中不明显或不存在，可能因为11α-OH-P4是小分子物质，在封闭过程中，其抗原表位可能被封闭液掩埋，因此特异性反应不明显。通过11α-OH-P4、HRP以及P4-HRP三者不同的紫外扫描曲线与峰值，鉴定抗原制备成功与否是本试验的关键。碳二亚胺法合成P4-HRP的过程缓慢而复杂，存在很多终产物，即使经过透析纯化，也可能存在载体蛋白及载体蛋白复合物，这些复合物的紫外扫描曲线与反应物的也不同。因此紫外扫描法不能完全判定偶联是否成功，还需结合免疫学检验进行鉴定。