非哺乳期肉芽肿性乳腺炎中亲脂性棒状杆菌的检测及抗菌药物的选择*

杨 玮，齐 艳，杨慧芬，罗 华

浙江省杭州市中医院：1.检验科；2.乳腺外科，浙江杭州 310007

肉芽肿性乳腺炎(GLM)是以乳腺组织肉芽肿形成为主要病理表现的乳腺慢性炎症，主要侵犯乳腺小叶，故也常称为肉芽肿性小叶性乳腺炎。该病近年来发病率有所上升，主要在育龄期女性产后几年发病，为一种慢性局灶性炎症。有关病因学说包括自身免疫反应或者乳汁的超敏反应、局部创伤、口服避孕药以及微生物感染，但至今其病因不明[1]。目前针对GLM患者的抗菌药物、激素及外科手术等治疗方法的效果往往有限，病情易复发，甚至根据影像学及临床表现易被误诊为结核性、真菌性乳腺炎或恶性病变，给患者带来很大的痛苦[2]。造成这些问题的部分原因是其病原菌为苛养菌，而常规实验室因培养基营养条件有限无法培养出，或培养出来被忽视为皮肤定植菌，或培养出来因实验条件有限无法鉴定，从而不能提供准确的病原学证据以致误导了临床的诊治。2002年以来，国外陆续有报道，GLM与感染有关，尤其是与克氏棒状杆菌的感染有关[3-4]，而国内文献罕见报道。本研究旨在探讨GLM患者乳腺穿刺液中分离出的亲脂性棒状杆菌的分布及对抗菌药物的敏感性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年9月至2018年5月杭州市中医院乳腺外科门诊收治的20例GLM患者为研究对象，患者年龄16～48岁，中位年龄34岁，1例为男性，其他均为女性。患者均通过乳腺细针进行穿刺，在穿刺液标本中分离得到20株纯培养、不重复菌株，菌株均为常规48 h不生长，但通过延长培养时间至72～96 h或厌氧培养分离得到。患者穿刺液标本均经病理诊断为GLM。患者相关临床资料及病原菌鉴定结果见表1。

1.2仪器与试剂 PCR扩增仪(德国Biometra公司)；3730测序列分析仪(美国ABI公司)；基质辅助激光解吸离子飞行质谱仪(MALDI-TOF-MS，德国Bruker公司)；Taq酶及PCR反应相关试剂(日本TaKaRa公司)；血平板，1%吐温-80血平板，1%吐温-80血MH平板(上海科马嘉生物科技有限公司)；E-test药敏条(温州市康泰生物科技有限公司)；厌氧发生袋(法国生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1质谱分子鉴定及16S rRNA测序分析 20株菌株经1%吐温-80血平板转种培养48 h后，进行MALDI-TOF-MS菌种鉴定，同时对提取的总DNA进行16S rRNA通用基因27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，正向引物)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，反向引物)序列的扩增。在20.0 μL的PCR反应体系中含有10×PCR Buffer(2.5 mmol/L，含MgCl2)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，引物量为8.0 pmol，Taq(5 U/μL)0.1 μL，加入约50.0 ng的模板DNA，其余体积以无菌超纯水补足。PCR扩增反应过程：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次，最后再72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。序列PCR扩增、凝胶电泳扩增产物及对扩增产物进行测序，再通过GenBank数据库进行比对，分析菌种名称。

1.3.2药敏试验 菌株经1%吐温-80血平板、35 ℃、5%CO2复活培养48 h后，制备0.5麦氏浊度新鲜菌液，用纤维聚酯棉签均匀涂布3遍至1%吐温-80血MH平板上，按照E-test药物塑脂条厂家说明进行药敏贴条，置于35 ℃、5%CO2培养48 h后读取最低抑菌浓度(MIC)值，根据欧洲药敏试验委员会(EUCAST)标准进行敏感性判读。

1.3.3亲脂性试验 菌株同时转种血平板和1%吐温-80血平板，置于培养箱培养48 h，肉眼观察平板上单个菌落生长情况。如果1%吐温-80血平板菌落直径比一般血平板大，即判为亲脂性试验阳性。

1.4相关指标定义 LogP系数是辛醇的化合物浓度与水中浓度的比值，是亲油性量度的分布系数，具有高LogP系数的抗菌剂优先分配给亲油性组织，正数为亲脂性，负数为亲水性。

2 结 果

2.1质谱分子鉴定及16S rRNA测序分析 GLM患者乳腺穿刺液分离到的20株菌株经过质谱分子鉴定及16S rRNA测序分析鉴定，有19株结果一致，其中16株均为克氏棒状杆菌，1株为结核硬脂酸棒状杆菌，2株为厌氧菌，分别为黑尔嗜胨菌和贪婪丙酸杆菌。MALDI-TOF-MS与16S rRNA测序结果高度一致，准确性达95%(19/20)。见表1。

2.2药敏试验 除1株结核硬脂酸棒状杆菌(M9)对所有受试的12种抗菌药物均表现为高度敏感外，其余17株棒状杆菌的药敏表型基本相同。根据2011年欧洲药敏试验委员会(EUCAST)标准进行敏感性判读，17株棒状杆菌对青霉素(P)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)、头孢呋辛(CXM)、头孢曲松(CRO)、米诺环素(MH)、利奈唑胺(LZD)、万古霉素(VA)均敏感，而对红霉素(E)、克林霉素(DA)MIC值大于32.000 μg/mL，耐药率均达到94.4%。部分菌株对左氧氟沙星(LEV)和四环素(TE)高度耐药，耐药率分别为22.2%、27.7%。结合药物Log P系数综合分析，对于由亲脂棒状杆菌引起的非哺乳期GLM的感染，建议选择脂肪组织分布较好的LZD、复方磺胺甲噁唑(SXT)、P等进行规范治疗。P、SAM、CXM、CRO、SXT、TE、DA、LZD、VA的LogP系数分别为0.76、-2.3/-1.5、-2.3、-1.8、1.28/0.79、-3.5、1.04、0.64、-4.4。其余抗菌药物的LogP系数在相关文献中未查到。见表2。

表1 20例GLM患者临床资料及乳腺穿刺液标本的病原菌鉴定

表2 18株棒状杆菌对抗菌药物的MIC(μg/mL)

续表2 18株棒状杆菌抗菌药物的MIC(μg/mL)

2.3亲脂性试验 结果显示，16株克氏棒状杆菌及2株其他种棒状杆菌亲脂性试验结果为强阳性，2株厌氧菌延长培养时间后也具有一定的亲脂性。

3 讨 论

非哺乳期乳腺炎的病原菌构成较为复杂[5]，其诊治相对比较困难，主要依靠临床表现、B超、病理检查、微生物培养。本研究对GLM患者的乳腺穿刺液培养48 h后报告阴性的标本通过延长培养时间及改变培养条件，共分离到罕见菌20株，其中16株均为克氏棒状杆菌，2株为结核硬脂酸棒状杆菌，2株为厌氧菌，体外试验提示所有棒状杆菌均表现了较好的亲脂性，这些均提示了克氏棒状杆菌等亲脂性革兰阳性菌在非哺乳期GLM中具有重要价值。由于乳腺组织具有富脂性，而常用抗菌药物多为亲水性，从而导致常规抗菌治疗疗效有限并易复发。本研究通过体外试验筛选出亲脂性较好且敏感性高的抗菌药物，从而可以指导临床进行合理使用。

克氏棒状杆菌是一种少见的革兰阳性亲脂性棒状杆菌，因该菌缺乏特征性的分支酸而在常规培养基培养48 h后难以生长，该菌在GLM的发病过程中具有重要作用，国外已有相关报道[3-4]。本研究分离得到的棒状杆菌均来自GLM患者的乳腺穿刺液且为纯培养，有3株菌株分别在其来源宿主中多次反复分离到，并且在大部分不同患者中均分离出同一种菌。由此可见，克氏棒状杆菌在GLM临床诊断中具有重要价值。因为克氏棒状杆菌具有亲脂性，也可见其在血液、心脏瓣膜、导管出口等富含脂肪组织部位感染的病例报道[6]。然而，目前大多数实验室对于常规培养基48 h不生长或者生长不良的菌株，或者生长出来但对其致病性不了解，常将其作为污染菌处理。同时，因目前使用的法国生物梅里埃API、VITEK2，美国BD公司的Phonix等生化鉴定系统的数据库目录中尚缺乏该菌名称从而导致常规实验室无法培养及鉴定出该菌。本研究证实MALDI-TOF-MS分析结果与16S rRNA测序结果高度一致，准确性可达95%，提示常规实验室应积极采用质谱仪才能准确进行菌种鉴定。鉴于该菌在GLM中的重要意义，进一步研发基于特异性免疫乳胶凝集或PCR探针等技术的快速诊断试剂盒，将有助于常规实验室对克氏棒状杆菌的快速筛查。此外，本研究中也分离到2株结核硬脂酸棒状杆菌，亲脂性试验也为阳性，说明其在GLM中也具有一定的价值，与国外病例报道一致[7]。另外对于M6菌株两种试验方法重复鉴定结果不完全一致，可能与菌株本身特性或实验技术有关，仍需进一步研究证实。

此外，本研究纯培养分离到2株乳腺来源的厌氧菌，目前国内外报道少见，分别为菌株A1黑尔嗜胨菌和A2贪婪丙酸杆菌，亲脂性试验也为阳性。黑尔嗜胨菌是少见的革兰阳性厌氧球菌，实验室易误鉴定为不解糖嗜胨菌，但其独立引起乳腺炎罕见报道[8]。贪婪丙酸杆菌一般定植在人体皮脂腺丰富部位，是一种生长缓慢、低毒力但易被临床忽视的革兰阳性厌氧杆菌，该菌具有一种特殊的类似胞外聚合物的结构，有助于形成生物膜，抵抗免疫清除作用，最终导致慢性的顽固感染[9]。目前国外有乳腺外科手术后发生慢性化脓性感染的个案报道[10-11]，本研究的唯一男性GLM患者临床情况与杨晓芳等[12]报道相似。因此，临床微生物实验室要重视乳腺脓液中厌氧菌的培养，降低漏检率，更好地指导临床诊治。

此外，本研究通过提高培养基脂质成分，可使亲脂棒杆状菌培养48 h后生长良好，提示针对乳腺等富含脂肪组织部位病原菌的分离建议使用富脂性平板，将会极大提高特殊亲脂性微生物的检出率。本研究使用的1%吐温-80血平板，在培养后平板因吐温的脂溶性往往促进羊血溶血。因此，添加富脂奶制品等优化培养基的研发正在进行中。

本研究中棒状杆菌的体外药敏试验结果显示，除E、DA整体表现为高度耐药及部分菌株对LEV高度耐药外，其他药物均表现较低的MIC。M9菌株为结核硬脂酸棒状杆菌，其体外药敏试验表现为高度敏感，与国外报道不同[7,13]。然而目前针对GLM的抗菌药物治疗效果不佳，可能原因如下：导致乳腺感染的病原菌多为富脂性，而临床常用药往往为水溶性抗菌药物。本研究中18株亲脂性棒状杆菌对亲脂性较高的DA却表现为高度耐药，因此建议使用Log P系数尚可且MIC非常稳定的LZD，与国外治疗成功的案例报道一致[14]。