原发传染性单核细胞增多症患儿血清sHLA-G水平与EBV-DNA载量的相关性分析

幸红军,朱明路

辽宁省沈阳市第四人民医院检验科，辽宁沈阳 110031

原发传染性单核细胞增多症是一种急性自限性传染病，主要是由EB病毒(EBV)感染所致，发病后可出现典型的三联征，表现为发热、咽峡炎、淋巴结肿大等，多发于学龄前和学龄儿童，尤其是婴幼儿[1]。多数患儿预后较为良好，但也有部分患儿容易出现噬血综合征等严重并发症，影响预后。临床上针对该病的诊断主要通过血常规、EBV抗体检查、EBV-脱氧核糖核酸(EBV-DNA)检测等确诊，但在实践中发现，不同患儿对EBV感染的反应不同，出现差异的原因与宿主的免疫反应不同有密切联系[2]。可溶性白细胞抗原G(sHLA-G)是机体重要的免疫抑制分子，目前有报道证实，当机体被病毒感染后，sHLA-G可在血浆中持续性高表达，并对病毒逃逸宿主免疫系统的攻击具有重要的监视作用[3]。但目前关于其在原发传染性单核细胞增多症患儿中的相关报道仍较少。本研究旨在探讨原发传染性单核细胞增多症患儿血清sHLA-G水平与EBV-DNA载量的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年4月至2019年4月本院接诊的60例原发传染性单核细胞增多症患儿作为观察组。纳入标准：(1)符合原发传染性单核细胞增多症诊断标准[4]，并通过临床症状、血常规、异型淋巴细胞计数、EBV抗体、EBV-DNA等检查得以确诊；(2)年龄3个月至3岁。排除标准：(1)先天畸形者；(2)脏器功能严重障碍者；(3)恶性肿瘤者；(4)近期接受过相关治疗者；(5)已出现并发症者；(6)近3个月内使用过激素、免疫抑制剂或增强剂者；(7)无法配合本研究者。并选择同期本院儿科健康体检儿童60例作为对照组，本组儿童近半年内未发生病毒感染，年龄3个月至3岁。所有受试者家属均知情同意本研究，并签署知情同意书。本研究通过本院伦理委员会审核。

1.2方法

1.2.1一般资料收集 收集所有受试者性别、年龄、身高、体质量等一般资料。

1.2.2血清sHLA-G水平检测 收集两组受试者清晨空腹静脉血5 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，混匀后静置30 min，于室温下以3 000 r/min的速度离心10 min，置于冷冻箱内储存以备检测。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测，试剂盒购于捷克Exbio公司。

1.2.3EBV-DNA载量检测 将静脉血置于枸橼酸钠抗凝管中，使用TaqMan荧光标记探针基因扩增技术(序列为PEEBV5′-XC-CTCGGA-CAGCTCCTAA-GAA GG-CACC-Y-3′，26 bp)进行检测。将各反应管置于实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测仪(DA7600型)中，通过下列条件进行扩增：分别在若干PCR反应管中加入处理后的2 μL样品上清液，以8 000 r/min的速度离心数秒置入RT-PCR检测仪样品槽中，按对应的顺序放置阴性质控品、阳性定量参考品和准备检测的标本。于93 ℃的环境下，预变性2 min，再变性45 s后在55 ℃的环境下变性45 s，反复进行30个循环。试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司。

1.2.4T淋巴细胞亚群检测 将收集至EDTA抗凝管的静脉血各取100 μL，分别加入带有相应荧光抗体20 μL的试管中，摇匀后于室温下避光保存15 min，使用标本制备仪进行自动溶血、固定，采用美国Beckman Coulter公司生产的流式细胞仪(EPICS-XL型)进行检测，检测指标包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。

2 结 果

2.1两组一般资料、血清sHLA-G水平和EBV-DNA载量比较 两组性别、年龄、身高、体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，观察组血清sHLA-G水平和EBV-DNA载量均明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料、血清sHLA-G水平和EBV-DNA载量比较

2.2两组T淋巴细胞亚群比较 观察组CD3+、CD8+明显高于对照组(P<0.05)，CD4+、CD4+/CD8+明显低于对照组(P<0.05)，见表2。

2.3血清sHLA-G水平与EBV-DNA载量、T淋巴细胞亚群的相关性分析 Pearson相关分析显示，血清sHLA-G水平与EBV-DNA载量呈正相关(r=0.483，P<0.05)，与T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均无相关性(r=0.029、-0.022、0.017、-0.084，P>0.05)。

表2 两组T淋巴细胞亚群比较

3 讨 论

EBV-DNA载量检测是目前诊断原发传染性单核细胞增多症患儿的重要手段，其可动态反映EBV感染后的病毒水平，且有助于避免单一检测易受体液免疫影响的弊端，结果准确，已普遍应用于该病的诊治，具有重要的应用价值[5]。近年来，诸多学者开始关注细胞免疫状态在原发传染性单核细胞增多症患儿中的表达及意义，并认为其在EBV感染过程中有着重要作用[6]。B淋巴细胞是EBV感染的重要靶细胞，B淋巴细胞在被EBV攻击后可发生改变，干扰机体的正常免疫机制，病毒长时间于细胞内潜伏，在一定条件下通过病毒基因、编码产物等途径对细胞基因产生影响，诱发疾病[7]。KALRA等[8]的研究显示，原发传染性单核细胞增多症患儿的临床症状与淋巴细胞活化具有密切关联，该病的发生可能和免疫抑制相关，而不是病毒复制直接诱发的。

sHLA-G是机体重要的免疫抑制分子，其可通过各种途径对CD4+、CD8+等各类免疫细胞的功能产生影响。目前已有研究证实，sHLA-G对T淋巴细胞的杀伤功能、NK细胞的杀伤效应、Th细胞的辅助功能、细胞因子的释放等具有抑制作用，而此类功能被抑制也是病毒逃避细胞免疫的机制[9]。本研究结果也显示，在原发传染性单核细胞增多症患儿中，sHLA-G水平明显高于健康儿童，提示在该病患儿中存在着免疫抑制表现。

T淋巴细胞亚群中，CD3+是反映T淋巴细胞活化程度的指标，CD4+是Th细胞和效应T淋巴细胞的表面标志物，Th细胞可通过释放多种细胞因子促进B淋巴细胞、效应T淋巴细胞的激活，加强机体免疫功能，而CD4+/CD8+则是反映机体免疫功能高低的重要指标[10]。本研究结果显示，在原发传染性单核细胞增多症患儿中，CD3+、CD8+明显升高，CD4+、CD4+/CD8+明显降低，提示患儿被EBV感染后，存在着明显的T淋巴细胞亚群紊乱表现，机体处于免疫紊乱状态。本研究通过相关性分析发现，血清sHLA-G水平与EBV-DNA载量呈正相关，分析患儿被EBV感染后，病毒可侵入细胞并发挥作用，对机体的正常免疫机制产生干扰，导致EBV-DNA载量的升高。但血清sHLA-G水平与T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均无相关性，提示血清sHLA-G的高表达和原发传染性单核细胞增多症患儿的免疫功能状态无关，sHLA-G并不直接影响患儿的免疫功能。闫临漪等[11]研究也显示，血清sHLA-G可能是和其他因素之间相互协同致使原发传染性单核细胞增多症患儿的免疫功能减弱。笔者认为也有可能是本研究纳入的患儿年龄过小，免疫系统尚未发育完善等因素所致，今后仍需扩大样本量继续研究。

综上所述，血清sHLA-G水平在原发传染性单核细胞增多症患儿中明显升高，且和EBV-DNA载量具有相关性，但血清sHLA-G水平的升高并不是造成患儿免疫功能降低的直接因素。