M血型检测的影响因素及M抗原与Mur血型的关联性*

李 乔，廖艳婷，孙爱农

广东省中山市中心血站检验科，广东中山 528400

MNS血型系统是继ABO血型系统后的第二大血型系统，其抗原和基因具有高度多态性且非常复杂，产生的抗原表型在不同的地区、种族中特异性明显。M抗原与Mur抗原属于MNS血型系统48个抗原之一，被国际输血协会(ISBT)分别命名为MNS1和MNS10[1]。在我国与Mur抗原相关的表型以GP.Mur最为常见[2]，其对应的抗体能够引起较严重的同种异体性免疫反应，如溶血性输血反应[3]、新生儿溶血病[4-5]和配血困难[6]等。因此，血型抗原的准确定型对输血安全和疾病预防有着重要的临床意义。目前关于M抗原与Mur抗原二者相关性的研究较少，本次试验主要探讨了M抗原与Mur血型的关联性及抗-M检测的影响因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取本站2020年7-8月581例献血者，其中男性占53%(309/581),中位年龄37岁。所有献血者采集5 mL EDTA-K2抗凝静脉血，4 ℃储存并在4 d内完成检测。从既往收集的献血者抗-M阳性血浆标本中选取不同抗体水平(效价)各3份，均属于IgM型。

1.2仪器与试剂 96孔U型底微量板(苏州康容生物医疗科技有限公司，批号：20191203)；全自动加样仪为瑞士哈密尔顿公司STAR-8CH型；常规离心机为日本久保田KA-2200和4200型(平板)；振荡仪为德国海德姆Titramax101型。单特异性抗-Mur试剂(批号M090622)来自本站制备的人源AB型抗-Mur，属于IgM/IgG混合性抗体[7]；单克隆抗-M来源于A、B、C 3个厂家(厂家A，批号：OMM157-1；厂家B，批号：020519C；厂家C，批号：20200324)；单克隆抗-N(厂家A，批号：ONM233-1)；抗体筛选红细胞来源于C、D两个厂家(厂家C，批号：20207013；厂家D，批号：20200407)。木瓜酶粉剂和IgG抗-D试剂(均为上海血液生物医药有限责任公司生产，批号：20190718和20190826)，1%木瓜酶应用液由本站配制。

1.3方法

1.3.1M/Mur抗原或抗体检测方法 微孔板盐水法：30 μL样本血浆或抗体试剂与20 μL 4%试剂或样本红细胞混合，振荡仪4 档(500 r/min)混匀30 s后，室温(24 ℃，下同)孵育15 min，期间不能震荡，200×g离心1 min，3 min内观察结果，出现凝集者为阳性反应，反之为阴性。试管盐水法参照文献[8]操作。

1.3.2两步酶法(试管法) 将1%木瓜酶稀释液分别与M/Mur抗原阳性的献血者红细胞等量混合，37 ℃孵育30 min，洗涤3次红细胞，用生理盐水配成4%酶处理后的红细胞悬液。将酶处理后的红细胞分别与人源性抗-M、阳性对照(IgG抗-D)、阴性对照(生理盐水)各50 μL混合，37 ℃水浴30 min，1 000×g离心15 s，观察结果。

2 结 果

2.1广东中山地区献血者M和Mur血型频率 选取581例献血者标本，分别进行M和Mur血型鉴定，其中M抗原阳性453例占78.0%(453/581)，Mur抗原阳性46例占7.9%(46/581)。

2.2M抗原与Mur抗原的关联性 将2.1筛得的46例Mur抗原阳性标本用单克隆抗-M试剂进行检测，结果显示M抗原均为阳性，Mur抗原中M抗原阳性者的发生频率为100.0%(46/46)。

2.3不同条件对人源性抗-M检测敏感性的影响

2.3.1温度对人源性抗-M的影响 采用试管盐水法对3例人源性抗-M进行效价检测，结果显示，孵育温度越低，人源性抗-M活性越高。见表1。

表1 不同温度下抗-M效价检测结果

2.3.2孵育时间对人源性抗-M的影响 室温条件下，观察不同孵育时间试管盐水法中3例人源性抗-M的效价，结果表明该方法中最佳孵育时间是15 min。见表2。

表2 不同孵育时间抗-M效价检测结果

2.3.3不同厂家试剂红细胞对人源性抗-M的影响 室温条件下，红细胞越新鲜，敏感性更高。纯合子(MM型)红细胞与人源性抗-M反应敏感性更强，不同厂家之间试剂的红细胞质量存在差异性，D厂家筛选红细胞的M抗原性强。见表3。

2.4不同厂家单克隆抗-M试剂比较

2.4.1不同温度对试剂敏感性的影响 试验结果显示，试剂孵育最佳温度为4 ℃和24 ℃。见表4。

2.4.2不同孵育时间对试剂敏感性的影响 试验结果显示，室温下，试剂最佳孵育时间是15 min。见表5。

2.5木瓜酶对M类抗体的影响 经木瓜酶处理后的M/Mur抗原阳性红细胞，与人源性抗-M和抗-Mur无凝集，与阳性对照(IgG抗-D)出现凝集，与阴性对照(生理盐水)无凝集反应。

表3 不同厂家试剂红细胞对人源性抗-M的效价结果

表4 不同温度下单克隆抗-M效价检测结果

表5 不同孵育时间下单克隆抗-M效价检测结果

3 讨 论

MNS血型抗原决定簇位于红细胞膜上的血型糖蛋白A和血型糖蛋白B上，并由相邻的GYPA和GYPB基因进行编码。M抗原是被鉴定的第1个MNS系统抗原，其决定簇存在于血型糖蛋白A上，由GYPA基因编码。Mur抗原属于MNS系统中的Miltenberger(简称Mi)亚系列抗原，表达在GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun、GP.Dane表型红细胞上。GP.Mur编码基因属于GYP(B-A-B)杂交基因，由GYPB基因假外显子3的部分片段被GYPA基因的相应片段所取代而形成[1]。因此，M抗原与Mur抗原二者关系密不可分，多数情况下应为同时表达。

本研究中，Mur抗原者中M抗原阳性的发生频率为100.0%(46/46)，其中仅有1例Mur抗原阳性而初筛M抗原为阴性、复查后变阳性的标本，疑为抗原凝集强度较弱导致了初筛M抗原的误判，经过不同厂家的抗-M血清再次复核后为M抗原阳性。有研究报道，中国人群中Mur抗原阳性而M抗原阴性的发生率为13.45%(16/119)[9]，亚裔美国人则为2.06%(2/97)[10]，本研究结果为0(0/46)，与文献数据不一致，今后还需要进一步分析原因。

抗-M以天然产生的IgM类抗体较多，为低温冷抗体，多在输血、妊娠和细菌感染等情况刺激下产生，并激活补体，可引起体内抗原阳性红细胞出现溶血反应。在结果2.3试验中，低浓度抗体若孵育时间不足易导致漏检，而为加强抗原抗体反应性本研究延长孵育时间至30 min，但效果并不明显，因此孵育时间以15 min、温度以4 ℃为最佳。试剂红细胞新鲜程度、厂家筛选红细胞试剂质量对抗原抗体反应的效价强度有一定的影响，即临近有效期的试剂有造成人源性抗-M漏检的可能，日常筛选试验中也应考虑这一点。红细胞膜上抗原表达纯合子(双剂量)要比杂合子(单剂量)更多，因此在与抗-M反应时，纯合子(MM型)红细胞比杂合子(MN型)红细胞反应效价更强，即“剂量效应”现象[11]。经木瓜酶处理后，红细胞中的MNS、Mia和Mur抗原结构遭到破坏，导致抗原抗体反应减弱或消失[1]。本试验结果与文献[12]报道的MNS血型系统的特性是一致的。

目前M血型检测主要依靠单克隆抗-M试剂，但结果2.4显示，单克隆抗-M试剂在不同条件下，对抗-M的敏感性存在差异。应尽可能选择抗体效价高的抗-M试剂。立即离心法或孵育15 min时需要抗-M效价达到1∶16，因为抗-M水平过低会导致M血型的漏检或误判。有研究报道，M抗原发生频率在深圳和温州分别为71.2%(685/962)[13]和78.4%(527/672)[14]，Mur抗原发生频率在广州和香港分别为9.7%(51/528)[2]和6.3%(392/6 241)[15]，本研究中M抗原和Mur抗原发生频率为78.0%和7.9%，符合该抗原在中国人群中发生频率的特点。

为防止漏检抗-M/抗-Mur类不规则抗体，应尽可能选择近期(距生产日期2个月内)或M血型为纯合子(若同时有Mur阳性更佳)的不规则抗体筛选红细胞，在出现疑难配血的情况下，应充分排除试剂、人员操作以及反应时间等影响因素。对于存在抗-M/抗-Mur的临床患者应提供M/Mur抗原阴性的同型输注，以提高输血质量和治疗效果，并减少输血不良反应的发生率。