国产药物、激素在羊超数排卵胚胎移植工作中的成功应用

赵 霞，乌仁图亚，苏雅拉图，吉林台

(1.内蒙古农农牧业科学院 内蒙古 呼和浩特 010031；2.赤峰市巴林左旗畜牧工作站；3.赤峰市巴林左旗乌兰达坝苏木动物防疫站；4.内蒙古农业大学)

随着人民生活水平的提高及人们对肉类消费需求量的不断上升，对羊肉的需求量也逐年增加。这种需求使得肉羊生产方式发生变化，已经向集约化、工厂化方向转变。但规模化生产肉羊仍然存在诸多的实际问题，如目前国内大部分技术人员依靠进口超数排卵药物和器械，使得胚胎移植成本提高以及肉羊扩大繁育技术成本高，导致导致该技术不能大面积推广而扩繁技术落后、规模化生产程度低，无法适时满足市场需求等弊端。在肉羊生产当中超数排卵、同期发情、胚胎移植等技术可以快速扩大繁殖优质种羊，在短时间内增加现有优秀种羊数量，为改良地方品种提供充足的优良种羊，利用杂交优势生产羔羊，提高我国肉羊生产水平之不可或缺的一项。促卵泡激素(FSH)是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，成分为糖蛋白，主要作用为促进卵泡成熟。促卵泡激素可促进卵泡颗粒层细胞增生分化，并促进整个卵巢长大。而LH可使卵母细胞恢复减数分裂、成熟卵泡分泌PGF2a，进而促进卵泡膜细胞释放胶原酶而溶解局部组织，当LH释放达到高峰时发生排卵，因此认为，超数排卵的过程就是应用超过体内正常水平的外源性促卵泡激素，使将要转化为闭锁卵泡的有腔卵泡发育成熟而排卵，所以上述FSH和LH常用于家畜生产中的超数排卵。目前在生产上主要采用成本较高的进口FSH而国产FSH被冷落，本研究对上述两种FSH的超排卵作用及其授精卵的受胎率进行对比，为将来全部使用国产药品降低超数排卵成本，以及为胚胎移植技术走向产业化发展及肉羊生产的产业化提供有利的理论依据。

1 材料

1.1 供体羊

赤峰市巴林右旗养殖户选取选择繁殖机能正常、体质健壮、营养状况良好，膘情中等以上的适龄母羊，并在预试期内完成驱虫和常规防疫注射。实验在巴林右旗养殖户进行。

1.2 受体羊的选择

选择养殖户2～3岁经产、健康、无繁殖障碍及生殖系统疾病的母羊为受体。

1.3 实验用药

垂体促卵泡素(FSH)规格100IU/支、人工合成促性腺激素释放激素(GnRH)规格100 ug/支，均购买自宁波第二激素厂;超数排卵药物FSH由加拿大(400 mg/20mL/支)、宁波激素(100 IU/支)生产。注射用垂体促黄体素(LH，200IU/支)、PMSG(1 000 IU/支)、孕酮海绵栓(42 mg/支)均由宁波第二激素制品有限公司生产，胚胎保存液(新西兰进口)，青霉素，生理盐水，碘酊，酒精，新洁尔灭等相关耗材。

1.4 试验用器材

羊胚胎移植用手术架(自制)，子宫角输精器(德国)，腹腔镜(德国)，实体显微镜，冲卵捡胚针，移植针，持针器，手术刀，手术用剪刀，缝合针及线，注射器。

2 方法

2.1 供体羊的超数排卵处理

采用常规递减注射法进行超数排卵处理。任选1天给供体羊阴道内放置孕酮阴道栓，放置阴道栓后的第13～14 d开始每天分上、下午按体重肌肉注射FSH。选用国产和进口两种FSH，各分3组进行剂量递减注射3 d。注射3 d国产FSH总剂量为160～220 IU、发现发情时注射120～160 IU 的LH；而注射3 d进口FSH总剂量为8～14 mL，且不需要注射LH。在超数排卵的第3 d早上(第五针的时候)取出阴道栓，晚上注FSH之前用试情公羊进行试情，如发情停止注射第六针。

2.2 供体羊的试情、配种

取栓后的12～24 h开始试情，早晚各1次。并对发情羊做标记，记录好发情时间。腹腔镜输精的羊输精前24 h开始空腹，发情后的30～36 h进行腹腔镜输精。

2.3 供体羊胚胎采集

供体羊发情后的72～80 h，用输卵管冲卵法采集2～4细胞期的胚胎。将供体羊仰卧手术架上保定好，手术部位按常规方法消毒并切口，在骨盆腔、膀胱周围触摸到子宫角，将其牵引出切口外，先观察记录卵巢表面黄体数量及滤泡数量。将装有5～10 ml生理盐水，连有头皮针的注射器，从子宫和输卵管的结合部扎入，针尖到达输卵管的狭部后用手指抓紧输卵管及扎入的针头，将软硅胶管或剪去针头的头皮针管，从输卵管喇叭口约插入3～4 cm，远端与表面皿衔接(但冲卵管不能与回收的冲卵液液面接触)，回收注入输卵管的冲卵液。并在实体显微镜下检查回收的胚胎质量、数量及胚胎发育情况。

2.4 受体羊的同期发情和管理

母羊阴道内放置孕酮阴道栓10～14 d，之后的任何一天取出栓(超数排卵供体羊与胚胎移植受体羊在数量上按比例同时取栓)，同时肌肉注射血促性素(PMSG)330 IU/只。受体羊移植手术前空腹24 h。

2.5 受体羊胚胎移植

把采集到的可用胚胎用相应的手术方法移植到同期发情处理的发情同步差在±24 h以内的受体羊体内。胚胎移植后40 d左右B型超声波检测仪鉴定其受胎率。

2.6 数据处理

数据处理采用单因素方差分析(ANOVA)法，P<0.05为差异显著。

3 结果与讨论

3.1 国产和进口不同FSH对超数排卵效果的影响

此次试验在乏情季节6月中旬在同一地点、同一饲养管理条件下，将用两种同来源的FSH进行超数排卵的供体羊随机各分3个组实施如表1所示。

表1 国产及进口FSH对超数排卵效果和成本对比

3.2 受体羊胚胎移植

因使用生理盐水进行冲胚，所以只把冲出来的部分A级胚胎移植到了48只受体羊体内，如表2所示，同样也取得了较好的产羔率。

表2 受体羊胚胎移植产羔情况

3.3 讨论

种羊的优劣是决定肉羊业健康、持续、稳步发展的关键所在。优质种羊是肉羊产业有效发展的基础。但目前肉羊行业管理混乱，缺少政策规划和技术指导的情况下任意炒作特定品种、以次充好、假冒伪劣猖獗等现象很普遍；再加上国内没有专门化生产牛、羊胚胎移植所需产品的专业厂家，移植所需用品及超数排卵药品都依赖于进口，使得胚胎移植成本提高，导致该项技术在畜牧业生产中不能像人工输精一样广泛推广和应用。

胚胎移植技术是对优秀的母畜进行超数排卵处理后，把超出自然排卵数量的几倍甚至几十倍的受精卵取出，移植到普通母畜体内，使之产出优秀后代的技术。利用这个技术很快扩大繁育优秀母畜和公畜，迅速提高群体的品质，为改良地方品种提供充足优秀种源，大大减少了直接引进大批公母畜所需的资金投入。

该研究中我们为了快速扩大现有优秀种公羊数量的同时降低超数排卵成本、对供体羊年龄、体重、胎次、膘情、超数排卵季节等因素进行综合评估的基础上，分别采用国产和进口FSH进行超数排卵，之后对生产的受精卵的品质、受胎率等进行了比较研究。在同一地点、同一时间、同一管理条件下饲养的羊只进行随机分组，根据羊只的体重等个体差异注射不同剂量的FSH进行超数排卵处理，使每组供体羊在自己最适宜的激素剂量下均获得了较好的超数排卵效果。如表1所示，分别使用国产和进口FSH进行超数排卵的供体羊均得到了较好的超数排卵效果。其中国产FSH处理的第二组供体羊中两只羊表现发情不稳定、进口FSH处理的供体羊中也有两只推迟发情的羊，但我们为取得完整试验数据仍按常规进行腹腔镜输精，继而进行采胚，所以采集到了未受精卵。

当我们进行大规模生产胚胎时，必须准确掌握供体羊的年龄、体重、繁殖性能，并按其个体差异、超数排卵季节等不同条件给予每个供体羊最适宜剂量的FSH、同时淘汰发情不稳定、推迟发情的供体羊，从而大幅度提高超数排卵效率，使得每一只供体羊都能够超数排卵成功，提高供体羊的利用率。不同来源(如不同厂家、不同原料)的激素制品，由于其制造工艺和提纯方法的不同其纯度与所含的有效成分不同、效价测定造成的误差、以及保存温度对生物活性的影响等都可能其效果。因此，为慎重起见，在一批激素大量使用以前，最好先做预备试验，根据试验情况，对这批激素的效价进行评估后，再进行大量使用为好。

试验中为降低成本我们尝试性使用生理盐水冲卵，试验结果显示，移植后同样获得了较好的产羔率。生理盐水，又称为无菌生理盐水，是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压基本相等的氯化钠溶液。用于哺乳类动物和人体时是0.85 %～0.9 %。其渗透压与人体血液近似，钠的含量也与血浆相近，但氯离子的含量却明显高于血浆内氯离子的含量，因此生理盐水只是比较地合乎生理，其用途为供给电解质和维持体液的张力。所以0.9 %的生理盐水可维持细胞的正常形态。

但值得注意的是使用生理盐水冲胚时，胚胎所需的营养物质如葡萄糖、牛血清白蛋白等的缺失，无法供给胚胎所需的营养环境；但在缺乏专用冲卵液的情况下，如果术者、捡胚者技术熟练，并增加胚胎在胚胎保存液中的冲洗次数、尽量做到胚胎的操作在无污染环境中进行，同样也可获得较好的产羔率。

本研究中用国产药物代替进口超数排卵药物进行超数排卵，每只供体羊所需FSH费用由1 200元左右降低到140元左右、每只受体羊同期发情费用由20元左右降低到15元左右元；试验根据以往的经验指定了合理用药方案(进口、国产FSH)平均采集胚胎数量均提高到10枚以上；已经达到国产药完全替代高成本进口药的目的，并减少了80 %～85 %的购药支出,权福生(2010)的研究也曾经提倡过用国产药物替代进口药物。本研究中对胚胎移植所需用品(除了胚胎保存液)全部使用国产药品，为使羊胚胎移植技术可以用最低成本，像人工输精技术一样推广应于广大农牧民畜牧业生产中在最短的时间内加快纯种扩繁，提高良种化程度，尽快实现肉羊的产业化生产、规模化生产胚胎提供了较可靠的数据。