中医药调节肠道微生态研究技术进展

李小雅,谭周进

李小雅,谭周进,湖南中医药大学,湖南省长沙市 410208

0 引言

近年来,中医药在调节肠道微生态治疗疾病中发挥重要作用,以中医药为靶点,选择合理的研究技术有利于全面了解肠道微生物群落结构和作用,充分挖掘其潜在价值.谢果珍等[1]对小鼠肠内容物中乳酸菌、双歧杆菌及大肠杆菌进行微生物培养时发现,铁皮石斛多糖可调节小鼠肠道菌群发挥“益生元”作用.王永安等[2]发现大承气汤可调节小鼠肠道菌群结构及多样性,恢复肠道细菌群落,达到治疗过敏性哮喘的效果.何云山等[3]发现保和丸治疗后食积小鼠肠道内容物及肠黏膜中木聚糖酶、淀粉酶以及蛋白酶的活性下降,揭示保和丸对食积小鼠的肠道酶活性的调节作用.唐圆等[4]发现痛泻要方能够使小鼠肠道内容物中微生物活度降低,肠黏膜微生物活度增加,初步阐明痛泻要方对肝气乘脾泄泻小鼠肠道微生物活度的作用机制.体外模拟实验可在一定程度上还原胃肠道状态,在探究葛根芩连汤在模拟胃肠液中对微生物生长的影响时发现[5],葛根芩连汤在模拟胃肠液中对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌均有较好的抑制效果,且随消化时间延长对各个细菌的抑制效果发生变化.本文将从微生物培养技术、分子生物学技术、酶学技术等方面概述中医药在调节肠道微生态领域的应用进展,为利用肠道微生态研究中医药理论及其应用提供方法学思路(见表1).

1 微生物培养计数法在中医药调节肠道微生态研究中的应用

肠道微生物培养是较为传统的微生物鉴定方法.中医药利用微生物培养技术在调节肠道微生态治疗疾病过程中发挥关键作用.龙承星等[19]对脾虚便秘及灌胃铁皮石斛多糖后小鼠肠内容物中乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌进行微生物培养,发现铁皮石斛多糖明显恢复了大肠杆菌的菌落数,乳酸菌和双歧杆菌明显减少,总数显著超过正常组,提示铁皮石斛多糖在一定程度上能扶植乳酸菌和双歧杆菌等有益菌,抑制大肠杆菌等有害菌,调控脾虚便秘小鼠肠道微生态平衡,优化肠道环境,改善脾虚便秘症状.唐标等[20]在探究降脂理肝汤对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠肠道微生物的影响时,发现降脂理肝汤能够抑制肠道细菌、大肠杆菌及乳酸菌的生长,使细菌总数和乳酸菌数量恢复至正常组水平,表明降脂理肝汤能调整非酒精性脂肪肝大鼠肠道菌群种群,改善肠道微环境紊乱的现象,达到治疗效果.肠道微生物培养技术已经逐渐深入到中医药调节肠道微生态治疗疾病的各个方面,选择符合培养条件的培养基对肠道中的细菌进行培养,通过检测肠道细菌数量变化初步衡量肠道菌群是否在疾病发生发展过程中及中药干预治疗后发挥作用,明确中医药作用的可培养菌类,为进一步从微观角度探索中医药调节肠道菌群治疗疾病的机制研究,为相关纯化及菌剂研究提供更为直接的证据.另外,微生物培养过程复杂,对分离物很难进行精确鉴定,导致研究微生物多样性的真实概况受到限制.鉴于此,我们可通过优化培养条件、改善培养基营养并综合其他分子技术,有助于评定特定肠道共生菌的功能,进一步阐述有益菌和致病菌之间的相互作用,为挖掘肠道微生物益生功能及抗病功能奠定基础.

2 分子生物学技术在中医药调节肠道微生态研究中的应用

2.1 基于核酸的分析技术

2.1.1 变性/温度梯度凝胶电泳技术:变性/温度梯度凝胶电泳(denaturing/temperature gradient gel electrophoresis,DGGE/TGGE)技术可直接分析样品总DNA的微生物多样性,在揭示微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优越性[21].邝枣园等[22]应用DGGE分析探讨黄连解毒汤对高脂血症小鼠肠道微生态的影响时,对各组小鼠肠道粪便的细菌群落进行聚类分析发现各组小鼠肠道菌群都建立了新的细菌群落结构,但部分组别细菌群落结构仍不稳定.而黄连解毒汤组可能从抑制肠道中某些细菌的生长方面,调节肠道形成新的、相对稳定的细菌群落结构,从而干预脂质代谢过程治疗高脂血症.杨泽锐等[23]从相似性系数角度分析红景天破壁饮片对小鼠肠道菌群影响时,发现在聚类分析中,各剂量组破壁饮片以及常规饮片组的组内相似度都会明显改变,说明服用破壁饮片和常规饮片之后比较有可能形成稳定的肠道菌群环境.应用DGGE/TGGE技术我们可以从对比不同微生物群落之间的差异变化方面,探究中医药在疾病的治疗过程可能的机制研究,对肠道微生物的群落的结构、功能和动态变化有着更好的阐述,为全面、快速、准确分析和鉴定复杂的肠道微生物提供新的方向.

表 1 肠道微生态研究技术

2.1.2 末端限制性片段长度的多态性技术:末端限制性片段长度的多态性(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技术以分子系统学原理为基础,运用了PCR、限制性酶切、荧光标记和 DNA 序列分析等技术,通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构和功能[24].Wu等[25]采用T-RFLP技术研究甘草中类黄酮异黄酮苷元调节结肠炎相关大肠癌(colitis-associated colorectal cancer,CAC)肠道菌群影响时,发现甘草中类黄酮异黄酮苷元改变了小鼠肠道菌群群落结构,其中Lachnospiraceae、Rikenellaceae含量降低、Helicobacteraceae含量增加,证明甘草中类黄酮异黄酮苷元可保护小鼠免受CAC的侵害,且它和肠道菌群可能具有协同的抗癌作用.与定性分析的DGGE/TGGE技术不同,T-RFLP技术可定性、定量分析微生物群落结构和功能.应用T-RFLP技术在短时间内对肠道中细菌群落以及群落中细菌组成定量分析,证实中药对疾病主要调控作用的肠道细菌靶点,为中药可能通过调节肠道微生物群来预防疾病发生发展提供新的证据.

2.1.3 扩增核糖体DNA限制性酶切片段分析技术:扩增核糖体DNA 限制性酶切片段分析(amplifed ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)技术是一种快速、有效的现代生物鉴定方法,在微生物遗传多样性及其分类研究中应用广泛[26].郭抗萧等[27]采用ARDRA技术研究七味白术散对菌群失调腹泻小鼠肠道菌群多样性的影响时发现,乳酸杆菌16S rDNA的PCR产物经酶切后传统汤药(七味白术散)组与模型组相比ARDRA条带增加,且接近于正常组,提示造模后小鼠肠道菌群失调,乳酸杆菌量减少,多样性下降;七味白术散治疗后可改变小鼠肠道菌群多样性,与正常组群落结构的相似性系数接近.根据ARDRA条带的丰富程度,我们可以看出肠道菌群群落的多样性,且ARDRA条带信号越强,表示肠道菌群中该物种的数量越多.从实验结果中证实了七味白术散能够促进乳酸杆菌的生长,增加乳酸杆菌的丰富度,为今后七味白术散应用于临床提供了新的方向.ARDRA技术能够在一定程度上反映出核糖体DNA的遗传多样性,通过ARDRA技术应用中医药领域的肠道微生态研究对微生物鉴定、共生菌、病原菌的微生物遗传多样性的检测,了解疾病过程中破坏肠道微生态的主要影响因素,以及建立中医药良性、稳定的肠道微生态结构具有重要意义,为今后开发有利于特异性中药抑制剂具有重要的实际应用价值.

2.1.4 基因芯片技术:基因芯片(Gene chip)技术又称DNA微阵列,能快速、准确、大规模地对获取样品核酸序列信息进行定性分析.Gene chip技术已应用于粪便、环境样本等的众多领域中,主要应用于基因表达分析、基因组测序、疾病诊断及药物筛选等方面[28].周鸿雲[29]在用Gene chip技术探索人参乌梅汤加味对腹泻模型大鼠结肠差异基因的分子调控机制发现,有17个基因表达上调,34个基因表达下调,提示中药对腹泻的调控是多层次、多靶点的.Gene chip技术不仅可以从基因层面初步揭示中医药应用肠道微生态治疗疾病的分子机制.而且由于不同基因存在不同功能,参与不同的信号通路,涉及疾病的多个阶段多个环节,互相之间存在着复杂的交互网络作用关系,它们可能单个发挥作用,可能需要多个基因同时参与某条通路或表达某项功能.基于此,我们也可以深入“中药组分-信号通路-调控”的新视角,宏观与微观结合系统研究中药复方多成分、多靶点、多途径作用机制,为进一步诠释中医药应用肠道微生态治疗疾病的现代科学内涵奠定基础.

2.1.5 荧光原位杂交技术:荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH) 技术对不同类群的微生物在细胞水平上进行原位的定性定量分析,描述微生物的形态特征、丰度以及在样品上的空间分布和动态[30].应用FISH技术探究中药多糖调节抗生素菌群失调小鼠肠道菌群变化时发现[31],中药多糖组中小鼠肠道双歧杆菌的含量较模型组升高,大肠杆菌的含量降低,提示中药多糖具有扶植肠道正常菌群生长的作用.实验中经中药多糖干预后快速有效地通过大肠杆菌探针对金葡菌、双歧杆菌等进行杂交检测,得到中药多糖可通过调节肠道菌群结构及丰度达到治疗抗生素引起菌群失调的现象.FISH方法在检测中医药调节菌群失调的应用较传统微生物培养法具有明显的优势,不仅能够对多种微生物进行定性定量检测,而且能够分析微生物群落及对特定菌群进行空间定位和原位生理学研究,提高了肠道菌群检测的速度和种类变化的准确度,有助于对中药发挥疗效功能进行准确、客观的评价,对中药的开发提供技术支持.

2.1.6 实时荧光定量PCR技术:实时荧光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技术即应用RT-PCR检测系统对实验反应过程中荧光信号的强度进行检测,通过标准曲线对未知模板进行定量分析.该技术能够分析明确肠道中某类有益菌和致病菌的定植规律,逐渐应用于人类以及动物肠道特定菌群的分析检测[32].在探究安肠汤治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)作用机制过程中,孙平良[33]应用RT-PCR技术检测大鼠肠内容物中各菌属基因表达,发现安肠汤对UC大鼠肠道菌属有明显的调节作用.曾艺鹏等[34]在探究葛根芩连汤治疗2型糖尿病湿热证对患者肠道菌群影响时发现,葛根芩连汤在一定程度上改善了肠道微生态,能有效抑制致炎细菌、促进益生菌的生长,从而达到治疗2型糖尿病湿热证的效果.RTPCR技术不仅可以从基因水平的量化检测来描述中药对肠道微生物的特定效应,而且可以对中药干预治疗后肠道中某些有益菌和致病菌的定植规律进行定量分析,这充分显现出肠道菌群中医药治疗疾病过程中的重要地位,日益凸显中医药在肠道菌群结构及细菌定量、病原检测、基因表达等方面的优越性.

2.1.7 高通量测序技术:高通量测序(high-throughput sequencing,HTS)技术能够以样品中各微生物基因组信息作为研究对象直接进行微生物组成的分析,可准确获得肠道微生物群落信息[35].而测序技术的发展由于测序原理、测序平台的不同也出现了较大的差异.其中二代测序可对多个样本进行测序,在单位时间内数据测序通量及产出量增长.与二代测序不同的是,三代测序技术测序过程更加简化,读长变长,可对16S rRNA基因全长进行测序,直接对给定的模板DNA或者RNA进行测序,实现真正意义上的实时测序[36].张晨阳等[37]应用高通量二代测序技术对小鼠肠内容物菌群16S rRNA基因V3-V4可变区进行扩增,探究番泻叶灌胃对小鼠肠内容物菌群的影响.结果发现番泻叶灌胃后可改变小鼠肠内容物菌群中Streptococcus,Sutterella和Dorea的变化.之后又利用高通量三代测序技术获取小鼠肠黏膜16S rRNA基因全长序列信息,分析小鼠肠黏膜微生物对肝气乘脾证泄泻的影响发现[38],模型组小鼠肠黏膜菌群多样性与空白组相比明显升高.其中Stigmatella aurantiaca、Candidatus arthromitus sp.SFB-mouse、Erythrobacter gaetbuli、Desulftobacterium hafniense、Ochrobactrum pituitosum和Candidatus arthromitus sp.SFB-mouse-NL明显降低,提示肝气乘脾证泄泻的发生与肠黏膜菌群多样性、群落结构以及相对丰度相关.虽然测序技术在短短几十年的时间里取得了突飞猛进的发展,但仍存在亟待完善的地方,二代测序在大基因检测时,其测序读长较短会产生大量高度碎片化的重复片段,对于后续测序拼接成为较大困扰;同时在测序读长时针对某一可变区域进行,读长长度较短;并且测序时间长,无法完全满足临床样本快速诊断的需要[39].而三代测序平台读长较长,测序错误率较高,后续数据处理分析较依赖处理软件与数据库的选择[40].基于HTS的宏基因组学技术通过提取肠道中的微生物总DNA、构建文库,可获得大量肠道微生物群落种类、丰度及相关生物学信息,为人类研究肠道营养健康提供支持[41].郭抗萧等[42]基于宏基因组技术评估七味白术散对肠道菌群失调腹泻的治疗机理发现,经七味白术散治疗后小鼠肠道菌群菌属结构以及多样性等发生明显改变,说明七味白术散可能对菌群失调腹泻小鼠肠道细菌群落有恢复的作用.

HTS技术不仅能够反映环境中微生物的群落结构,而且在以功能基因为核心的分子生态学研究也备受青睐[43].mcrA基因编码mcr的A亚基,可作为肠道甲烷产量的生物标记物检测产甲烷菌的多样性和系统发育情况,对于研究针对性减少甲烷的方法具有积极作用[44].硫酸盐还原细菌(sulphate-reducing bacteria,SRB)的功能基因dsrB可鉴定SRB物种信息来探究炎症性肠病与SRB之间的可能联系,为之后中医药治疗提供指导性建议[45].贺璐等[46]探讨四磨汤对脾虚便秘小鼠肠道细菌功能基因的影响时,发现四磨汤可通过提高肠道细菌能量和营养物质的代谢,提高遗传信息的复制、转录、翻译和跨膜转运水平来达到治疗脾虚便秘的效果.微生物的各种转化功能主要依赖酶来完成,通过编码相关酶的功能基因作为微生物功能标记物,成为了微生物多样性研究的新方向[47].在探究七味白术散对菌群失调腹泻小鼠肠道黏膜细菌乳糖酶基因多样性的影响时,龙承星[48]发现七味白术散对小鼠肠道黏膜细菌乳糖酶基因的多样性和丰度有明显恢复作用,能够修复小鼠肠道黏膜细菌产乳酶基因的群落结构.实验试从肠道黏膜细菌乳糖酶基因多样性层面进一步探讨七味白术散对菌群失调腹泻疗效的认识,为阐明七味白术散对菌群失调腹泻疗效的现代生物学机理提供佐证.由此可以看出,中医药发挥疗效时可通过借助高通量测序技术从肠道菌群中的物种组成分析、多样性分析、物种差异分析、功能基因等方面准确获取肠道微生物信息,揭示多种肠道疾病相关的分子机制,为之后进一步挖掘中医药作用的具体作用靶点(如针对某一通路或功能预测)埋下伏笔,也为更好探究中医药与肠道微生物的关系提供研究基础.

2.2 基于蛋白质的分析技术 随着蛋白质组学技术日趋成熟,蛋白质组学在促进中医药肠道微生态领域发展的同时,中医药研究也为蛋白质组学提供方向与动力,已成为蛋白质组学的重要研究领域之一[49].王佳等[50]探讨健脾祛痰化瘀法对脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马猪小肠差异蛋白的影响时发现,健脾祛痰化瘀中药方影响脾虚痰浊动脉粥样硬化巴马猪小肠多种蛋白表达,涉及细胞黏附分子、脂肪消化和吸收、胆汁酸分泌等通路,提示该方通过调控这些关键通路蛋白的表达改善巴马猪小肠消化吸收功能异常,进而改善脾虚痰浊动脉粥样硬化.蛋白质组学的快速发展为我们深入研究疾病过程中蛋白质表达和功能作用提供了可能.蛋白质组学技术可以在整体水平上检测出疾病中一些特异蛋白的表达,明确疾病过程中相关蛋白的表达和功能变化,加快对疾病病理改变的认识.将中医药现代化研究与蛋白质组学研究结合,从微观角度探讨中药复方作用机制,为中医药的证候治疗提供准确分子标志物,以此针对性的达到治疗的效果.

2.3 基于代谢产物的分析技术 肠道细菌代谢产物如短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)在机体生理和病理过程中扮演着重要角色.随着关于SCFAs在机体中的作用研究的不断深入,越来越多的实验要求对人或实验动物粪便或肠内容物种中短链脂肪酸含量进行方便、快捷的测定[51].目前的检测方法以色谱技术较为常见.在探究肺系调治方治疗小儿反复呼吸道感染的实验中,吴月滢[52]发现肺系调治方可促进大鼠肠内容物中乙酸、丙酸、正丁酸的表达,提示肺系调治方治疗小儿反复呼吸道感染的作用机制可能与大鼠肠内容物中增加的SCFAs有关.李慧等[53]探讨黄连解毒汤对小鼠粪便中SCFAs代谢的影响时发现,灌胃黄连解毒汤后小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸含量显著升高,提示黄连解毒汤可能促进了肠道菌群代谢,从而导致其代谢产物短链脂肪酸增加.通过应用色谱技术检测SCFAs的含量变化可以间接的反映出机体肠道细菌的变化,有利于挖掘肠道中产乙酸、丙酸、丁酸的肠道有益细菌,是中医药通过促进这些有益细菌生长及靶向调控防治多种人体疾病的潜在重要方法,以此为中医药防治疾病及药物研发提供新的研究思路.

3 肠道酶活性检测技术在中医药调节肠道微生态研究中的应用

酶能在温和的条件下,高效率促进生物体的新陈代谢.肠道功能酶是机体肠道内重要组成部分,影响机体营养物质吸收、免疫以及生长发育[54].酶活性检测技术已逐渐应用于肠道内容物以及肠黏膜各种功能酶活性的检测中.吴仪等[55]用痛泻要方治疗肝气乘脾泄泻小鼠,应用酶活性检测小鼠肠黏膜前、中、后段及肠内容物中消化酶活性发现,与自然恢复组比,中药干预组小鼠肠内容物中乳糖酶活性升高,肠道前段黏膜纤维素酶活性显著降低,肠道中段黏膜蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶活性升高,肠道后段黏膜乳糖酶、蔗糖酶活性显著升高,提示痛泻要方对肝气乘脾泄泻小鼠肠道消化酶活性具有调节作用,但对于肠道不同部位消化酶活性调节作用有所不同.谭周进等[56]发现七味白术散对菌群紊乱腹泻的肠道微生态环境具有调整作用,之后在探究七味白术散对抗生素所致腹泻小鼠肠道乳糖酶活性的影响时发现,七味白术散治疗后小鼠肠道黏膜乳糖酶活性恢复且提高,说明七味白术散可促进腹泻小鼠肠道黏膜乳糖酶活性恢复而治疗腹泻[16].基于此,通过检测肠道中各种消化酶活性发现,中药不仅可以通过肠道黏膜影响肠道消化酶的分泌量,使肠道消化酶活性发生变化,而且还会影响肠道微生物使肠道酶的来源受到影响,进一步阐明中药对肠道消化酶活性的调节机理,为之后从酶活性角度探索中药调节肠道菌群治疗疾病提供思考.

4 肠道微生物活度检测技术在中医药调节肠道微生态研究中的应用

微生物活度检测技术最早应用于土壤微生物检测当中,肠道中不同种类的酶能够反映微生物参与生化反应的活跃程度,也是微生物活度检测的重要指标[57].荧光素二乙酸(fluorescein diacetate,FDA)能够被细菌及真菌中的非专一性酶水解,我们常通过测定样品FDA水解程度体现肠道中微生物的总体活度[58].惠华英等[17]在研究葛根芩连汤对肠道湿热证泄泻小鼠肠内容物及肠黏膜微生物活度影响时发现,治疗组小鼠肠内容物及黏膜微生物活度降低向正常组水平变化,提示葛根芩连汤治疗肠道湿热证泄泻可能与肠道微生物活度有关.肠道微生物活度可在一定程度上反映肠道微生物的总体代谢能力,肠内容物以及肠黏膜中微生物活度的不同提示处于此处的肠道微生物的种类、丰度等有所差异,不同种类、丰度的肠道微生物必然会影响微生物总体代谢能力.通过肠道微生物活度检测可明确中药治疗疾病过程中对于肠道微生物总体代谢能力的调控作用,丰富了中医药治疗与肠道微生物的关系,也为今后从肠道微生态出发探讨中医药治疗临床疾病的机理打开一扇新的大门.

5 其他检测技术在中医药调节肠道微生态研究中的应用

体外模拟胃肠系统是一种基于生理学模拟生物体进行生物学研究的创新技术.针对肠道益生菌的开发与应用,胃肠道环境耐受性试验已成为一个主要内容.我们通常采用体外模拟胃肠道环境模型对其进行评价,为更好的评估益生菌的适应性及其科学有效的使用提供依据.刘艳平等[59]在探究知母皂苷BⅡ模拟人体胃肠道环境的稳定性研究时,发现知母皂苷BⅡ在人工胃液、人工肠液中能稳定生存,不会发生明显降解,这对于知母皂苷BⅡ剂型选择和生物利用度改善具有重要意义,也为进一步阐明知母的体内药效物质提供参考.

6 结论

肠道微生物的平衡与宿主的健康和疾病有着密切的关联.中医药通过调控肠道微生物中菌种结构组成,从而维持肠道微生态平衡,对疾病的治疗有显著效果.目前,分子生物学技术被广泛运用于中医药调节肠道微生态研究中,通过分子生物学技术来探讨肠道微生态的平衡与紊乱,阐释肠道微生物与宿主的生理及病理相关性,揭示多种肠内外疾病中医症候表现的分子机制,为中医药治疗肠道微生态相关疾病提供理论依据和研究基础,这对于全面了解中药药效物质基础,为中医药在调节肠道菌群方面取得新的突破性进展,推动中药现代化研究进程具有重要的意义.相较于传统的肠道微生物研究方法,目前的技术手段已经取得了非常大的进步.但是这些技术仍然存在缺陷,对于研究肠道微生物来说仍显不足,如对于样品的处理方式应有所突破,样品信息的处理仍需优化.在未来,随着分子生物学自身的发展,期待有更简便快捷的方法出现,并结合目前已有的研究技术,按照需求进行选取以更有效地达到实验目的,而借助生物大数据的方法可能会是未来研究的发展方向.