基于全基因组测序对双重耐药幽门螺杆菌外排泵基因变异的研究

叶淑芳,张剑美,代 飞,蓝陈菊,章小君,周丽珍,汤清清,孟 飞

叶淑芳,张剑美,代飞,蓝陈菊,章小君,周丽珍,丽水市人民医院消化内科,浙江省丽水市 323000

汤清清,孟飞,杭州致远医学检验所有限公司,浙江省杭州市 310000

0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染存在于50%以上的世界人口,并已证实它与慢性胃炎、消化性溃疡等多种上消化道疾病相关[1].克拉霉素和左氧氟沙星是H.pylori根除治疗的常用药物,但是随着抗生素的广泛使用,克拉霉素及左氧氟沙星等的耐药率越来越高,抗生素耐药成为H.pylori感染患者根除失败的主要原因[2].

H.pylori对克拉霉素耐药已经证实与23S rRNA的结构域V区肽基转移酶中的点突变相关[3],最常见的突变是位置A2142G和A2143G.H.pylori对喹诺酮耐药主要是由于gyrA喹诺酮类药物耐药决定区基因发生突变,gyrA基因主要有下列两种突变(Asn87,Asp91)[4].此外,目前有不少研究报道外排泵基因过表达可以增加菌株的耐药性的[5,6].在肠杆菌科细菌中,最常见的外排泵为耐药结节化细胞分化家族(resistance nodulation cell division family,RND),而该家族中研究较深入的就是AcrAB-外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP)ToIC参与的外排泵系统.ToIC可以与许多内膜转运体结合,参与几乎所有的抗生素外排过程,因此对细菌的耐药性及临床治疗都有重要影响[7,8].

与常规方法相比,二代测序可提供有关细菌基因组信息的深入信息.这些技术全面追踪抗生素耐药性菌株的基因组信息,能促进临床对感染患者进行特异性和合理治疗.

在本研究中,我们首先通过呼气试验及药敏试验筛选出10例H.pylori菌株,包括5例双重耐药菌株和5例全敏感菌株,用PCR方法进行验证并进行全基因组测序.我们着眼于双重耐药外排泵的变异,这些变异对内在和获得性抗生素耐药性都有贡献,阐明耐药新机制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本收集:选取因胃部疾病至丽水市人民医院就诊的胃镜检查患者,于胃镜下采集胃黏膜标本一份,置于组织保存管中,低温运输送检.该研究已通过丽水市人民医院伦理委员会审核.所有患者均同意在本研究中使用其样品,并签署了知情同意书.

1.1.2 病例入选标准:(1)年龄18-70岁,男女不限;(2)呼气试验结果为H.pylori阳性;(3)近2 wk内未使用抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂或PPI制剂.病例排除标准:(1)严重心、肝、肾功能损害者;(2)妊娠或哺乳期妇女;(3)有食管、胃肠手术史者;(4)患者不能正确表达自己的主诉,如精神病、严重神经官能症者;(5)患者同时服用非甾体抗炎药或酗酒.

1.2 方法

1.2.1H.pylori培养及药敏:胃粘膜标本经过研磨后接种于含5%羊血的哥伦比亚培养基,37 ℃微需氧培养(5%O2、10% CO2、85% N2)2-3 d,观察菌落的生长情况,经生化反应(尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶)试验和镜检鉴定,确定为H.pylori菌株后保存菌株.

采用琼脂稀释法进行药敏检测:将生长出的H.pylori菌株分别收集于生理盐水中,配制成吸光度2-3麦氏的菌悬液,滴加于抗生素平板上,每滴2-3 μL,每个平板滴数在15-25滴之间.建立平行一组,空白对照一组.于37 ℃微需氧培养(5% O2、10% CO2、85% N2)的条件下培养2-3 d,判读药敏结果,若有H.pylori菌株生长则为耐药,无H.pylori菌株生长为敏感.其中克拉霉素及左氧氟沙星的耐药临界值分别为1 μg/mL和2 μg/mL.质控菌株为H.pyloriATCC26695.

1.2.223S rRNA及gyrA基因突变的特异性PCR:PCR体系包含2×Mix(杭州擎科生物技术有限公司)15 μL,5×Enhancer buffer 6 μL,dd H2O 5 μL,引物Forward和Reverse各1 μL和2 μL DNA模板.引物序列如下:23S rRNAForward:ATGAATGGCGTAACGAGATG;23S rRNAReverse:ACACTCAACTTGCGATTTCC;gyrAForward:GATCATAGGGCGCGCTTTACC;gyrAReverse:AAGTCGCCATCCCTACAGCGA.PCR条件如下:94 ℃2 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s和72 ℃ 10 s,30个循环;72 ℃5 min.PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳确定大小.

1.2.3 基因组DNA提取和全基因组的制备:用Qiagen细菌基因组提取试剂盒提取H.pylori基因组DNA.用Qubit检测试剂盒(Invitrogen公司,美国)测量每个样品的DNA浓度.通过使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒(Illumina公司,美国)进行H.pylori菌株文库的构建.根据试剂盒说明书将DNA均匀剪切成500 bp左右的片段,并加上接头序列构成DNA文库,然后在Illumina MiSeq测序仪上运行.使用MiSeq控制软件分析荧光图像,并使用MiSeq Reporter Analysis创建FASTQ格式的序列数据.

1.2.4 序列读取和单核苷酸变体(single nucleotide variants,SNV)检测:重测序下机数据经过处理后获得原始数据,为了降低突变的错误率,过滤掉起始的10个碱基,并截断了每个>Q20读数的末端30个碱基,然后利用BWA[2](version 0.7.12)比对软件,将clean data比对到参考基因组序列上,统计比对结果,包括比对参考序列reads数,平均深度及覆盖率等.参考基因组选用ATCC26695.通过比对结果,去除出每个文库中由于PCR扩增引起的重复序列,然后使用SAMTOOLS(version 1.1)软件进行SNV/InDel鉴定,通过SAMTOOLS的Mpileup模块和Bcftools分析每个位点具体的测序信息等.

1.2.5 临床H.pylori菌株中的双重耐药外排泵的变异:为了鉴定这些临床分离菌株中的其他可能变异,我们接下来检查了与TolC同源物的四个基因簇的遗传变异.将不同来源的H.pylori耐药基因与参考菌株26695(GenBank登录号:NZ CP010436)进行比对,并结合耐药实验结果,分析耐药机制间的关系.

统计学处理通过独立t检验分析了外排泵基因的遗传变异与耐药性表型之间的关联.使用95%置信区间,P<0.05被认为具有统计学意义.所有统计分析软件采用SPSS 24.0.

2 结果

2.1 患者收集情况 2014-06至2015-06,共入选患者60名,入选患者年龄在18-70岁之间,平均年龄为46.93岁,男女比例为1.4:1.男女间年龄不存在统计学差异.

2.2H.pylori培养及药敏结果 本实验共分离获得H.pylori菌株51例.药物敏感实验结果见表1.其中克拉霉素和左氧氟沙星都耐药的有5例,克拉霉素与左氧氟沙星都敏感的有13例.克拉霉素耐药率达到43.1%,左氧氟沙星耐药率达到41.2%.

2.3 PCR分析结果 选取对克拉霉素及左氧氟沙星都耐药的H.pylori菌株5例及对克拉霉素及左氧氟沙星均敏感的菌株5例进行特异性PCR扩增.

两种不同抗性的菌株测序结果如图1所示.在对两种抗生素都耐药的菌株中23S rRNA基因中2143位均具有A>G变异,gyrA基因中有4例在87位变异,1例在91位变异.而在5个克拉霉素及左氧氟沙星敏感株的23S rRNA及gyrA基因的相同位置上没有有义变异.因此,PCR结果与药敏结果一致.

2.4 外排泵基因中编码序列(coding sequence,CDS)变异分析 临床分离株中外排泵基因CDS变异数见表2.对TolC同源物的四个基因簇SNV与临床分离株耐药性相关性分析,没有发现外排泵中SNV总数与敏感和耐药菌株之间存在显着差异.

我们对外排泵编码基因簇中的SNV进行了更详细的分析,在双重耐药性H.pylori菌株中发现一个突变的SNV.在5株克拉霉素及左氧氟沙星耐药的菌株中,HP0970中存在C111T突变而在5株敏感菌株中未发现该突变.没有发现敏感菌株中突变而双重耐药菌株中不突变的位点.这些结果表明外排泵基因中的突变SNV可能有助于菌株对抗生素的耐药性分布.

3 讨论

目前H.pylori感染的治疗方法主要基于质子泵抑制剂与阿莫西林和克拉霉素等抗生素联用[9],但标准的三联疗法的治愈率已逐渐降低到不可接受的水平[10].共识指出[11],当克拉霉耐药率高于15%-20%时,不应使用三联疗法来治疗H.pylori感染,应考虑其他治疗方案.克拉霉素及左氧氟沙星是根除H.pylori感染的常用药物,然而这两种药物的广泛使用导致H.pylori原发性耐药的增加.一项研究表明,H.pylori对常用抗生素的三重耐药率达到了7.8%[12].

本研究药敏试验表明,丽水地区克拉霉素及左氧氟沙星的耐药率都达到了40%以上,高于浙江省地区的平均水平(克拉霉素16.1%,左氧氟沙星19.5%)[13].说明近些年这两种抗生素在丽水地区一直在广泛使用,应高度重视抗生素的应用,防止滥用.

H.pylori菌株中23S rRNA基因及gyrA基因位点突变与菌株对克拉霉素及左氧氟沙星产生耐药是目前的已知机制,此外,H.pylori对抗生素耐药性似乎与其他因素有关,例如对克拉霉素产生耐药性还与菌株rRNA甲基化酶的产生[14],大环内酯灭活酶的作用以及主动外排泵基因突变有关[15],这些在多种细菌中都有描述,但缺乏其他遗传机制的证据.还有一些研究表明,其他细菌遗传因素也可能导致耐药性增加[16].但是,尚无有关H.pylori其他细菌因素的遗传证据.

表 1 H.pylori 临床分离菌株药敏结果

应用PCR方法检测H.pylori23S rRNA及gyrA基因中的突变,确认了这些突变结果与药敏结果相同.PCR利用特异性引物测定突变基因的方法已经比较完善,可以明确鉴定H.pylori菌株对克拉霉素或左氧氟沙星相关耐药基因的突变.PCR是用于鉴定一个碱基对基因变异的有效方法,但全基因组测序可以同时检测多个碱基对变异.我们通过基于大规模Illumina的平台对H.pylori分离株的整个基因组进行全基因组重测序.测序结果可以清楚地区分H.pylori基因组中的23S rRNA及gyrA基因中的点突变.为了未来的H.pylori感染治疗有更多方法,我们需要知道双重耐药菌株外排泵基因的变异是否是菌株耐药性产生的内在因素.RND家族转运蛋白是微生物外排系统中的重要组成部分.RND类外排泵是革兰氏阴性菌产生多重耐药的重要原因[17].在H.pylori26695基因组中,存在编码RND类外排泵的基因,包括TolC同源物的四个基因簇HP0605-HP0607(hefABC),HP0971-HP0969(hefDEF),HP1327-HP1329(hefGHI)和HP1489-HP1487[18].本研究发现在双重耐药菌株中的H.pylori外排泵系统的四个基因簇(HP0605-HP0607,HP0971-HP0969,HP1327-HP1329和HP1489-HP1487)中存在一个位点突变,而敏感菌株中没有.这表明外排泵基因可能有助于微生物耐药性的产生,这与其他研究结果类似.

本研究探索了双重耐药H.pylori的外排泵的重要性.外排泵基因的特定变异与克拉霉素和左氧氟沙星耐药表型之间存在联系[5,6].这些基因突变的确切机制尚不清楚.内在耐药性的可能机制包括减少药物吸收或增加药物外排.本研究结果表明外排泵基因的变异可能与临床分离物中的药物敏感性相关,药物耐药的相关基因突变可能引导外排泵基因同时突变.全基因组测序数据包括目前无法从小规模分析中获得的大量其他信息.

表 2 临床分离株中外排泵基因编码序列变异数

图 1 耐药基因突变位点分析.

4 结论

我们通过PCR的方法验证了H.pylori耐药性的基因型,并揭示了全基因组测序在H.pylori耐药分析中的潜力.研究结果表明了克拉霉素及左氧氟沙星耐药性菌株中外排泵基因变异的重要作用.由于我们入组患者数据量较小,结果还需进一步验证.因此可以使用全基因组方法进行进一步分析大数据的双重耐药H.pylori临床分离菌株以获得更准确的数据.

文章亮点

实验背景

目前抗生素耐药已经成为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染患者根除失败的主要原因.外排泵基因与抗生素耐药存在一定的关联性,先前的不少研究已证实外排泵基因过表达可以增加菌株的耐药性的.

实验动机

外排泵基因的研究可以解决当前H.pylori耐药基因研究不足的缺点,研究结果对未来幽门螺杆菌耐药机制起到一定的数据支持作用.

实验目标

本实验将找出双重耐药菌株与敏感菌株外排泵基因存在的变异,探索外排泵基因的变异与双重耐药菌株耐药性产生的内在联系.

实验方法

用13C呼气试验及药敏试验筛选出双重耐药菌株及敏感菌株,用特异性PCR的常规方法进行耐药基因突变位点的验证,基于MiSeq平台,分别对双重耐药菌株及敏感菌株进行全基因组测序,以鉴定双重耐药表型与敏感表型的外排泵基因的单核苷酸变体(SNV)并进行分析.

实验结果

筛选出双重耐药菌株5株,特异性PCR耐药基因突变位点验证发现5株临床双重耐药菌株中检测到23S rRNA基因及gyrA的点突变,而在5株临床敏感菌株中未检测到.在5株克拉霉素及左氧氟沙星耐药的菌株中,HP0970中存在C111T突变而在5株敏感菌株中未发现该突变.

实验结论

本研究发现在双重耐药菌株中的H.pylori外排泵系统的四个基因簇中存在一个C111T位点突变,而敏感菌株中没有.这表明外排泵基因可能有助于微生物耐药性的产生.

展望前景

利用全基因组测序对H.pylori外排泵基因进行研究,揭示了全基因组测序在H.pylori耐药分析中的潜力,对于H.pylori基因型与表型的关系有了新的认识,对未来关于H.pylori耐药机制的研究起到一定的数据支持作用.