miRNAs指标在非小细胞肺癌患者血清中的表达及临床意义

王佩瑾，林赟羽

(宁海县第一医院 呼吸科，浙江 宁波 315600)

非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常见的肺癌病理学亚型，主要有腺癌(AC)和鳞状细胞癌(SCC)[1]。早期准确诊断对NSCLC患者的治疗十分重要[2]。miRNAs对细胞发育、分化、增殖和凋亡等生物学和病理学过程有重要影响，在肿瘤中可作为致癌基因(onco-miRNA)和肿瘤抑制miRNA[3-4]。无细胞miRNAs在体液(血浆、血清和尿液等)中可稳定存在，显示了miRNAs作为肿瘤早期诊断标志物的潜力[5-6]。本研究旨在评估5种miRNA(miR-21-5p，miR-30a-5p，miR-126-3p，miR-210-3p，miR-486-5p)在NSCLC患者血清样本中的表达水平及其诊断能力，以期为NSCLC的早期诊断提供依据。

1 材料和方法

1.1 一般资料 收集2009年1月—2013年3月于宁海县第一医院治疗的符合中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)[7]诊断标准的原发性NSCLC患者50例，纳入标准：①均经细胞学检查或病理组织学明确诊断为NSCLC；②均未接受过抗肿瘤治疗，包括放疗、化疗、手术及靶向治疗等。排除患有其他系统疾病患者及孕妇、哺乳期女性患者。NSCLC患者中男38例，女12例；平均年龄(65.9±2.3)岁；根据美国癌症联合委员会第7版原发肿瘤局部淋巴结远处转移分期(TNM)[8]对NSCLC组分类：AC患者14例，SCC患者30例，6例患者肿瘤成分复杂；T1期7例，T2期28例，T3期10例，T4期5例。另选取29例健康个体为健康对照组，其中男23例，女6例；平均年龄(70.1±3.0)岁。本研究经医院伦理委员会批准，所选患者均签署知情同意书。

1.2 血清miRNA水平检测 空腹取静脉血约5 mL于无菌EDTA抗凝管中，室温下静置30～60 min，1 300 g离心10 min，取血清于-80 ℃保存。取血清1 mL加入Trizol 提取总RNA。采用逆转录和实时荧光定量PCR法，检测血清中5 种miRNA表达。逆转录程序：在去核酶PCR 薄管中加入反应物，

充分混合3～5 s，70℃ 孵育5 min，迅速放入冰中冷却。再加入其他反应物充分混匀，短暂离心，42℃ 孵育90 min，70℃ 加热10 min，冷却终止反应。扩增基因片段：95℃预变性1 min，95℃ 15 s、60℃ 20 s、70℃ 25 s，40个循环，然后95℃延伸反应20 s。以U6作为内参，采用 2-ΔΔCT法进行相对定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0统计学软件。采用Shapiro-Wilk检验正态分布，通过Levene检验检查方差的同质性。组间计量资料比较采用t检验，采用Pearson相关系数检验miRNA水平之间关联性，采用Cox比例风险模型评估miRNA水平和患者总生存时间(OS)的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC患者血清miRNA表达 与健康对照组比较，NSCLC组患者血清中的miR-21-5p、miR-30a-5p和miR-126-3p下调，miR-210-3p和miR-486-5p上调，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

与健康对照组比较，**P<0.01,***P<0.001。图1 NSCLC患者血清miRNA表达水平Figure 1 Serum miRNA expression in patients with NSCLC

2.2 不同病理特征NSCLC患者miRNA水平 比较5种miRNA 在NSCLC腺癌和鳞状细胞癌中的表达水平，miR-210-3p在NSCLC腺癌和鳞状细胞癌患者血清中的水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同病理特征NSCLC患者miRNA水平Table 1 MiRNA levels in NSCLC patients with different pathological features

2.3 miR-210-3p对NSCLC腺癌的诊断价值 MiR-210-3p对NSCLC腺癌的ROC曲线下面积为0.84(95%CI: 0.72～0.96)，敏感度为86%，特异度为79%，见图2。

图2 miR-210-3p对NSCLC腺癌诊断的ROC曲线Figure 2 ROC curve of miR-210-3p for NSCLC adenocarcinoma

2.4 miRNA水平与总生存时间的关系 NSCLC组中17名患者总生存时间数据缺失，对33名NSCLC患者进行分析。结果显示，调整性别、年龄和吸烟时间因素后，NSCLC患者miR-210-3p水平与总生存时间相关(P=0.03)。见表2。

表2 NSCLC患者miRNA水平与总生存时间的关系(n=33)Table 2 Relationship between miRNA level and overall survival in NSCLC patients(n=33)

3 讨论

研究[9]表明，缺氧条件下miR-210-3p在多种癌症中表达上调，其可能作为致癌基因和肿瘤抑制因子。本研究结果显示，miR-210-3p在NSCLC患者血清中表达明显上调。先前报道[10-11]指出，miR-210-3p在NSCLC患者血清和血浆样品中上调，与本研究结果一致。另外，本研究结果显示，与鳞状细胞癌相比，NSCLC腺癌miR-210-3p表达明显上调，miR-210-3p对NSCLC腺癌的ROC曲线下面积为0.84。Shen 等[12]研究结果表明，miR-210-3p诊断腺癌比诊断鳞状细胞癌具有更高的敏感度。本研究结果表明，血清miR-210-3p与NSCLC患者总生存时间存在潜在关联。早期研究[13]表明，miR-210-3p在NSCLC组织中的高表达与更长的存活率相关。而另一项研究[14]观察到，腺癌组织中miR-210的高表达是缩短腺癌患者无病生存期的独立预后因素，相关结果还需进一步大样本验证。

以往研究[15-16]显示，与健康对照组相比，miR-126-3p在NSCLC患者中表达水平下调[16]，可作为NSCLC潜在的血液生物标志物，与本研究结果一致。研究[17]报道，miR-30a-5p在NSCLC患者血清中明显上调，但在癌组织样品中表现出上调，本研究结果显示，miR-30a-5p在NSCLC患者血清中明显下调。此外，miR-21-5p在NSCLC患者血清样本中下调，与Abdollahi等[18]研究结果一致，该研究显示NSCLC患者中miR-21-5p显著升高，且与肿瘤分期相关。本研究结果显示miR-486-5p在NSCLC患者血清中上调，而Shen等[12]报道miR-486-5p在NSCLC患者血清中下调，且与NSCLC患者的总生存时间相关。另有研究[19]报道miR-486-5p的高表达可作为一种优化预后因子，而Li等[20]的研究则表明miR-486-5p表达上调与不利生存相关。

综上，本研究结果显示miR-21-5p、miR-30a-5p、miR-126-3p、miR-210-3p和miR-486-5p在NSCLC患者血清中表达水平改变。miR-210-3p对NSCLC腺癌有一定的诊断价值，后续需进行大样本量验证。