PRAME mRNA和SOX9 mRNA在肺腺癌中的表达及临床意义*

韩文慧，邓慧兰，王 辉，何萌萌

青岛市胶州中心医院呼吸一科，山东青岛 266300

肺癌是临床常见呼吸系统恶性肿瘤，发病原因复杂，起源于支气管黏膜或腺体，早期无明显临床症状，70%以上的患者确诊时已发展为中晚期，占我国恶性肿瘤死亡原因首位[1]。黑色素瘤特异性抗原(PRAME)是一种表面抗原，基因定位于染色体22q11上，编码509个氨基酸的蛋白质，与恶性血液性疾病及多种实体肿瘤的发生、发展、预后密切相关[2-3]。性别决定基因盒9(SOX9)是SOX家族研究最为广泛的一员，基因定位于染色体17q24.1～q25.1区域内，包含3个外显子及2个内显子，在胚胎、性腺发育中起重要作用，且与多种肿瘤的发生、发展有关[4-5]。本研究主要探讨PRAME mRNA和SOX9 mRNA在肺腺癌中的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年2月至2018年4月在本院接受手术治疗的肺腺癌患者73例为研究对象，其中男性41例，女性32例，年龄41～67岁，平均(57.61±8.23)岁。均于术中收集肺腺癌癌组织及癌旁正常组织标本，并立即置液氮中速冻，于-80 ℃冰箱保存。根据病理分级分为：高分化10例，中分化32例，低分化31例；根据《国际肺癌研究协会第八版国际肺癌TNM分期》[6]分为：Ⅰ期12例，Ⅱ期34例，Ⅲ期27例；根据有无淋巴结转移分为：无淋巴结转移44例，有淋巴结转移29例；根据肿瘤大小分为：肿瘤直径<3 cm者38例，肿瘤直径≥3 cm者35例。纳入标准：(1)接受根治性手术切除；(2)术后病理确诊为原发性肺腺癌；(3)术前未接受放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗；(4)临床资料完整。排除标准：(1)未经病理学证实；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)合并心、肺、肾等脏器严重疾病；(4)认知障碍或因其他原因无法配合定期随访。根据随访结果将研究对象分为预后良好组(62例)、预后不良组(11例)。预后良好组男性34例，女性28例；年龄43～66岁，平均(57.65±7.62)岁。预后不良组男性7例，女性4例；年龄41～67岁，平均(57.38±7.15)岁。预后良好组与预后不良组性别、年龄相比，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准，患者及家属同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达的检测 采用实时荧光定量PCR检测肺腺癌癌组织及癌旁正常组织中PRAME mRNA、SOX9 mRNA的表达。采用Trizol法提取组织中总RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增反应。PRAME正向引物：5′-CTG TAC TCA TTT CCA GAG CCA GA-3′；反向引物：5′-TAT TGA GAG GGT TTC CAA GGG GTT-3′。内参基因β-actin正向引物：5′-TCG TCG ACA ACG GCT CCG GCA TGT-3′；反向引物：5′-CAT TGT AGA AGG TGT GGT G-3′。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环，72 ℃延伸5 min。SOX9正向引物：5′-GCG TAT GAA TCT CCT GGA CC-3′；反向引物：5′-GCG GCT GGT ACT TGT AAT CC-3′。内参基因GAPDH正向引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′；反向引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。引物及试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司，操作严格按照说明书进行，采用2-ΔΔCt法计算PRAME mRNA、SOX9 mRNA的相对表达水平。根据癌旁正常组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA相对表达水平的中位数将癌组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA分为高、低表达。

1.2.2随访 以肺腺癌患者术后第1天作为随访起点，以电话、门诊、住院的方式进行为期24个月的随访，术后1年内每3个月进行1次随访，之后每6个月随访1次，以肺腺癌患者肿瘤复发或发生死亡为终点事件，随访截止日期为2020年4月30日，随访终点为出现终点事件或随访期满。出现终点事件者纳入预后不良组，未出现者纳入预后良好组。

2 结 果

2.1不同组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达比较 与癌旁正常组织相比，肺腺癌癌组织PRAME mRNA的相对表达水平降低(P<0.05)，SOX9 mRNA的相对表达水平升高(P<0.05)。见表1。

2.2肺腺癌癌组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 肺腺癌癌组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)，与病理分级、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表2。

表1 不同组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA的相对表达水平比较

表2 肺腺癌癌组织PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达与临床病理特征的关系

2.3肺腺癌癌组织PRAME mRNA表达与SOX9 mRNA表达的相关性 Spearman相关分析结果显示，肺腺癌癌组织PRAME mRNA表达与SOX9 mRNA表达呈负相关(r=-0.559，P<0.001)。见图1。

2.4PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达与肺腺癌患者的预后关系分析 与预后良好组相比，预后不良组肺腺癌患者PRAME mRNA的相对表达水平降低(P<0.05)，SOX9 mRNA的相对表达水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 预后良好组、预后不良组肺腺癌患者PRAMEmRNA、SOX9 mRNA的相对表达水平比较

2.5影响肺腺癌患者预后的危险因素分析 以肺腺癌患者预后状况作为因变量(预后良好赋值为0，预后不良赋值为1)，以PRAME mRNA、SOX9 mRNA、病理分级、临床分期、淋巴结转移作为自变量进行COX回归分析，将PRAME mRNA高表达、SOX9 mRNA低表达、高中分化、临床分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移均赋值为0，PRAME mRNA低表达、SOX9 mRNA高表达、低分化、临床分期Ⅲ期、有淋巴结转移均赋值为1。COX单因素分析结果显示，PRAME mRNA表达、SOX9 mRNA表达、病理分级、临床分期、淋巴结转移差异均有统计学意义(P<0.05)；COX多因素分析结果显示，PRAME mRNA低表达、SOX9 mRNA高表达、低分化、临床分期Ⅲ期、有淋巴结转移均是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表4、5。

图1 肺腺癌癌组织PRAME mRNA表达与SOX9 mRNA表达相关性散点图

表4 影响肺腺癌患者预后危险因素的单因素分析结果

表5 影响肺腺癌患者预后危险因素的多因素分析结果

3 讨 论

肺癌是最常见的恶性肿瘤，可根据生物学特性分为小细胞肺癌、非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占肺癌发病率的75%～80%，包括腺癌、鳞癌及大细胞癌3种病理类型，其中肺腺癌占比超过50%[7-8]。近年来，肺腺癌诊断及治疗方案不断发展、进步，但预后效果仍不理想，肺腺癌患者5年生存率仅为4%～17%[9]，因此，越来越多的研究致力于寻找有效的生物标志物及潜在治疗靶点，以期提高生存率。

PRAME于1997年在黑色素瘤患者中被首次发现，能够被细胞毒性T细胞特异性识别并使肿瘤溶解，是肿瘤睾丸抗原家族的一员。PRAME可参与调控细胞周期及细胞增殖、凋亡过程，与血液系统疾病的关系研究较多，在慢性粒细胞白血病加速期的早期阶段即有增高现象，且早于白血病细胞数的增多，可能成为疾病进展的生物标志物[10-11]。PRAME已被报道与肺癌关系密切，不同病理类型的肺癌存在不同的治疗靶点，对肺腺癌有效的靶向药物可能对肺鳞癌无效，PRAME在肺癌中的表达情况也因病理类型不同存在差异[3,12]。王芳等[3]研究发现，原发性肺腺癌患者癌组织PRAME表达较癌旁正常组织低，且与患者病情严重程度相关。雄英等[12]通过高通量转录组测序结果发现，与癌旁正常组织相比，肺鳞癌癌组织中PRAME为高表达，可能为肺鳞癌的靶向治疗提供参考依据。本研究发现，与癌旁正常组织相比，肺腺癌癌组织PRAME mRNA的相对表达水平降低，提示PRAME mRNA可能参与肺腺癌的发生；进一步研究发现，PRAME mRNA表达与肺腺癌患者病理分级、临床分期、淋巴结转移有关，提示PRAME mRNA可能参与肺腺癌的病情进展；与预后良好组相比，预后不良组PRAME mRNA的相对表达水平降低，提示低表达的PRAME mRNA可能与不良预后有关，可能成为肺腺癌的预后标志物。

SOX家族是一类参与早期胚胎发育的核转录因子，有20多个功能相似的成员，均含有保守基因序列，可以特异性结合DNA。近年来，SOX家族在恶性肿瘤诊断、治疗方面的临床应用潜力受到越来越多的关注[13-16]。王征等[17]研究发现，甲状腺癌癌组织中SOX9表达较癌旁正常组织高，且与临床分期、包膜浸润、淋巴结转移有关，对甲状腺癌患者预后生存状况也有一定评估价值。刘艳玲等[18]研究发现，SOX9在口腔鳞癌癌组织中呈高表达，与肿瘤体积、临床分期、淋巴结转移及患者存活率均有关，可能成为口腔鳞癌临床病情及预后的有效标志物。邓程伟等[19]通过在肺腺癌细胞中转染SOX9小干扰RNA1使SOX9实现低表达，转染后细胞与未转染细胞相比增殖活性降低，细胞凋亡率增高，提示下调SOX9可对肺腺癌细胞的增殖产生抑制作用，促进其凋亡进程。本研究结果显示，与癌旁正常组织比较，肺腺癌癌组织SOX9 mRNA的相对表达水平升高，且其表达与患者病理分级、临床分期、淋巴结转移均有关，提示SOX9 mRNA可能参与肺腺癌的发生、发展；Spearman相关分析结果显示，肺腺癌癌组织PRAME mRNA表达与SOX9 mRNA表达呈负相关，提示SOX9 mRNA可能通过下调PRAME mRNA的表达参与肺腺癌的病情变化；与预后良好组比较，预后不良组SOX9 mRNA的相对表达水平升高，提示SOX9 mRNA可能与患者预后状况有关。COX回归模型分析结果显示，PRAME mRNA低表达、SOX9 mRNA高表达、低分化、临床分期Ⅲ期、有淋巴结转移均是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素，可能为肺腺癌患者预后状况的评估提供一定参考。

综上所述，PRAME mRNA、SOX9 mRNA与肺腺癌患者的病情进展密切相关，可用于临床评估患者病情，同时，PRAME mRNA低表达、SOX9 mRNA高表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素，可用于患者预后风险评估，有助于及时进行干预以提高患者预后状况。但本研究也存在一定不足，仅对肺腺癌癌组织中PRAME mRNA、SOX9 mRNA表达及关系做了初步分析，未对其具体机制进行深入研究，另外样本量少也可能导致结果存在一定偏差，后续工作将以此为重点展开。