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HCV单克隆抗体的制备及其应用的初步研究

2021-05-12江苏省医疗器械检验所江苏南京210012

中国医疗器械信息 2021年7期
关键词:包被单克隆抗原

江苏省医疗器械检验所 (江苏 南京 210012)

内容提要: 目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染已成为全球公认的健康难题,目前并没有很好的疫苗和特效药,尽早检出HCV感染者是实现丙型肝炎早期诊断、阻断传播的重要途径。方法:研究通过免疫Core-NS4B融合重组蛋白,制备抗HCV单克隆抗体,并获得5H5和4E7-HRP最优的抗体配对组合,检测120例血清,同时与HCV-RNA检测做比较。结果:阴性血清均未测出阳性,HCV阳性标测出23例阳性,检出率77%,HCV-RNA测出26例,检出率87%;HCV可疑标本测出15例阳性,HCV-RNA测出17例;单项ALT增高的标本测出2例阳性,HCV-RNA测出1例。结论:研究所获得的抗体能够用于HCV抗原检测,具有巨大的潜力,为建立HCV抗原检测试剂盒奠定了基础,为临床检测提供了实验依据。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)属黄病毒科,是一种主要经过血液传播的病毒,可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌,感染后肝硬化发生率在20年内达30%,30年内达50%,对人类健康构成了极大危害。丙型肝炎(Hepatitis C,HC)呈世界性分布,全球约有近1.8亿HCV感染者,每年新增300万到400万人,每年超过35万人因丙型肝炎相关疾病死亡,HCV感染已成为全球公认的健康难题[1-4]。截至2015年,全球仅20%的慢性HCV感染者得到明确诊断,其中仅7.4%获得治疗[5]。中国属于HCV的中流行区和高流行区,感染率约为3.2%[6]。

2016年5月28日,第69届世界卫生大会上世界卫生组织(WHO)通过了《2016-2021年全球卫生部门病毒肝炎战略》[7],即“至2030年消除病毒性肝炎的公共健康威胁”。2017年11月我国发布了《中国病毒性肝炎防治规划(2017-2020年)》,并于提出了“至2030年彻底消除丙型病毒性肝炎”的政府承诺[8]。“十二五”期间,丙肝高发地区的防治工作被列入国家重点攻关课题[9]。HCV核心抗原检出时间早于抗体,缩短了检测“窗口期”,可用于丙型肝较的早期诊断[10]。研究表明,HCV非结构蛋白4B(Nonstructural Protein 4B,NS4B)可能参与宿主细胞的多种信号转导通路,干扰转录调控、内质网应激、恶化等过程[11]。本研究利用HCV核心抗原(Core)和NS4B融合表达构建的Core-NS4B融合重组蛋白备抗HCV单克隆抗体,用所获得抗体进行配对并筛选,并对120份血液样本进行检测,同时与HCV-RNA检测方法做比较,为HCV临床检测提供了实验依据。

1.材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

雄性Balb/c小鼠(扬州大学实验动物中心),Core-NS4B融合重组蛋白(本室构建),HAT、HT、PEG 1500、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂(Sigma公司),辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(北京碧云天生物技术有限公司),小鼠Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞(本室保存),DMEM培养基(GIBCO公司)、细胞培养板(NUNC公司),Protein A亲和层析柱(GE),丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒(广州达健生物科技),其他试剂均为分析纯。96孔聚苯乙烯酶标板(Corning)、酶联免疫检测仪(Thermo)。

1.2 单克隆抗体的制备

1.2.1 动物免疫

用Core-NS4B融合重组蛋白免疫5只6周龄雄性Balb/c健康小鼠。首次免疫用弗氏完全佐剂与Core-NS4B抗原溶液1:1混合乳化,在小鼠后颈背部多点注射,其中抗原用量为每只小鼠100μg。第2次免疫在2周后,弗氏不完全佐剂与与Core-NS4B抗原溶液1:1混合乳化,后颈背部多点注射。4周后做第3次免疫,再次颈背部多点注射。5周后,用间接ELISA法测小鼠血清抗Core-NS4B效价,在其中挑选1只免疫情况最好的小鼠,在准备融合的前3d加强免疫,方法:腹腔注射抗原液100μg。

1.2.2 间接ELISA方法的建立

以免疫小鼠血清作为阳性对照,SP2/0细胞上清作为阴性对照,Core-NS4B融合重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA筛选方法。Core-NS4B融合重组蛋白包被浓度为5μg/mL,每孔100μL,37°C孵育1h;PBST清洗5次,每孔加1% BSA 200μL,37°C孵育1h;PBST清洗5次,每孔加融合细胞上清100μL,每块酶标板各设一阴阳对照孔,37°C孵育1h;PBST清洗5次,每孔加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100μL,37°C孵育1h;PBST清洗5次,加入TMB底物显色液,37°C作用15min,2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪测定OD值,波长为:450nm,判定依据:OD450≤0.3判断为阴性,OD450>0.3,判断为阳性。

1.2.3 杂交瘤细胞株的建立

取小鼠骨髓瘤Sp2/0-Agl4细胞(对数生长期)与免疫脾细胞按1:5的比例用50% PEG进行融合,免疫小鼠血清为阳性对照,Sp2/0-Agl4细胞培养上清为阴性对照,用间接ELISA检测培养上清。选择强阳性克隆,用有限稀释法连续克隆化3~4次,直至有克隆孔的抗体100%阳性。将建立的稳定分泌高特异、高效价抗HCV单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养后,置液氮中保存。

1.2.4 腹水抗体的制备

采用小鼠体内繁殖法大量制备单克隆抗体。6~8周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡(0.5mL/只),2周后,将已扩大培养的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔(2×106个/只),10d后收集腹水,以间接ELISA法对腹水抗体效价进行测定,12000r/min,4°C离心30min,取上清备用。

1.3 抗体的纯化及测定

用Protein A亲和纯化小鼠腹水,用SDS-PAGE法对抗体纯度进行鉴定,并用凝胶成像系统进行分析,采用紫外吸收法对抗体浓度进行测定,将抗体均稀释到1mg/mL对其进行效价检测。

1.4 ELISA法单克隆抗体配对

1.4.1 单克隆抗体结合位点的分析

用ELISA相加实验测定OD450值,抗体之间产生相加效应的程度用指数AI=(2A1+2/A1+A2-1)表示,A1,A2表示不同单克隆抗体分别单独与抗原作用时的OD450值,A1+2表示两种单克隆抗体混合后于抗原作用时的OD450值,AI>50%表示两种单抗针对不同的抗原表位。

1.4.2 单克隆抗体配对

采用夹心ELISA法,分别包被HCV单抗,包被浓度10μg/mL,Core-NS4B溶液稀释到5μg/mL加样,HRP标记抗体按照1:1000稀释加样,不同表位的抗体两两组合,TMB显色,测定OD450值。

1.5 血清标本检测

标本来源:南京市某医院体检血清标本120例,其中体检合格标本30例,HCV阳性标本30例,HCV可疑标本30例,单项ALT增高的标本30例。

双抗夹心检测:采用夹心ELISA法,包被HCV单抗,加血清标本,加HRP标记抗体,TMB显色,测定OD450值。

HCV—RNA检测:采用广州达健生物科技有限公司生产的丙肝病毒PCR检测试剂盒,按说明书上的方法操作。

2.结果

2.1 单克隆抗体的制备

细胞融合筛选,最终获得10株杂交瘤细胞,分别命名为1F8,2E6,2F1,3C5,3H3,3H11,4E7,5F10,5H5,6E5,注射到小鼠腹腔。每株获取8~12mL的优质腹水并取5mL进行纯化,获得抗体300~800μL。如表1所示,纯化后蛋白含量13.1~20.3mg/mL,凝胶成像分析纯度达到89%~92%,抗体效价为40万~640万。

2.2 单克隆抗体的配对

2.2.1 单克隆抗体结合位点的分析

在间接EHSA试验中,当Core-NS4B蛋白的包被浓度为5μg/mL时,10种抗体对应的效价为其饱和时的最大稀释度。保持Core-NS4B融合重组蛋白包被浓度为5μg/mL不变,将各株单抗两两以各自饱和时的最大稀释度加入同一个包被有Core-NS4B抗原的孔内作为一抗,间接ELISA反应后,测定450nm处的光吸收值,并计算相加指数AI。

表1. 10株抗体的浓度、纯度及效价

ELISA相加试验结果显示,2F1,3H3,4E7,5F10,5H5分别与其他9株单克隆抗体之间的相加指数AI大于50%,1F8,2E6,3C5,3H11,6E5五种单克隆抗体相互之间AI指数小于50%,说明2F1,3H3,4E7,5F10,5H5可能与Core-NS4B抗原结合的位点不同,1F8,2E6,3C5,3H11,6E5可能与Core-NS4B抗原结合位点相同。结合抗体效价等多方面原因,最终选择2F1,3H3,4E7,5F10,5H5,6E5进行下一步实验。

2.2.2 单克隆抗体配对

2F1,3H3,4E7,5F10,5H5,6E5六种单抗分别用作包被抗体及酶标抗体,交叉检测人Core-NS4B抗原。其中抗体包被量均为10μg/mL,酶标抗体按1:1000倍稀释使用。配对初筛中Core-NS4B融合重组抗原按5μg/mL使用。初步配对结果显示,单抗配对4E7-5H5在双抗体夹心法中有最好的检测效果(表2),因此选取5H5-4E7-HRP对进行配对检测血清样本。

表2. 单抗配对初筛结果

2.2.3 血清标本检测

用筛出的抗体对5H5-4E7-HRP检测120例血清标本,结果显示,体检合格的30例血清均未测出阳性。HCV阳性标本30例测出23例阳性,HCV可疑标本30例测出15例阳性,单项ALT增高的标本30例测出2例阳性(见表3)。用HCVRNA试剂盒检测上述样本,结果显示,HCV阳性血清标本测出26例阳性,HCV可疑血清标本测出17例阳性,单项ALT增高标本测出1例(见表3)。由此可见,5H5和4E7抗体配对能较好地测出HCV抗原,为临床检测HCV试剂盒的开发奠定了基础。

表3. 配对抗体5F9+1H11-HRP灵敏度检测

3.讨论

HCV是一种单股正链RNA病毒,其基因组由3个结构区和4个非结构区组成。HCV核心蛋白(Core)是结构区的基因编码的一种结构蛋白,结构相对稳定,抗原性强,具有蛋白的免疫优势区,在病毒装配与成熟过程中起关键作用,具有多种类型的生物活性,是与宿主细胞相互作用的重要环节,在HCV感染后的免疫逃逸中发挥重要作用[12,13]。NS4B是HCV的一个非结构蛋白,参与病毒复制和丙肝病理变化过程,NS4B相对于其他非结构蛋白在病毒进化上较为保守[14]。因此,制备Core和NS4B抗体对HCV检测具有重要的意义。

本研究通过免疫Core-NS4B融合重组蛋白,制备抗HCV单克隆抗体,获得5H5-4E7最优的抗体配对组合,并用筛出的抗体检测120例血清标本,同时与HCV-RNA检测做比较。结果显示,体检合格的30例血清均未测出阳性,HCV阳性标本30例,抗体对测出23例阳性,阳性检出率77%,HCVRNA测出26例,阳性检出率87%;HCV可疑标本30例,抗体对测出15例阳性,HCV-RNA测出17例;单项ALT增高的标本30例,抗体对测出2例阳性,HCV-RNA测出1例。充分说明本研究所建立的双抗夹心检测HCV抗原的体系能够初步应用于临床HCV抗原检测,具有巨大的潜力,为建立HCV抗原检测试剂盒奠定了基础,为临床检测提供了实验依据。

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