鸭疫里默氏菌病疫苗的应用现状与展望

万 明，曹中赞，于 堃，卢立志，栾新红

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.浙江省农业科学院畜牧兽医所，浙江杭州 310000)

鸭疫里默氏菌病又叫鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症等，是由鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的一种水禽急性或慢性接触性传染病。最初是在1904年Riemer报道了鸭疫里默氏菌感染鹅的情况，当时称之为“鹅渗出性败血症”，随后德国学者Floren和Wiedeking等发现水禽都是该菌的易感动物。Cooper G L等[1]发现鸭疫里默氏菌与火鸡的脊髓炎有关，而且Charles S D[2]等发现鸭疫里默氏菌病会伴随火鸡新城疫的发生而出现。1988年，Hatfield R M和 Morris B A通过试验分别经肌肉、口腔、鼻腔接种该菌，证明最佳投菌途径是肌肉注射，这给日后做攻毒试验提供了理论依据[3]。1993年，Leavitt S等[4]从家鸭中分离出该菌，随后该病在世界各地都有发生。在我国1982年郭玉璞等[5]首次报道了北京鸭场鸭疫里默氏菌感染情况。目前，国际上公认该菌共有21个血清型，我国流行较多的是1型、2型和10型，其他血清型伴随发生，各个血清型之间无交叉保护，因此给该病的免疫预防带来很大的困难。目前治疗该病的主要方法是药物治疗。但是随着临床药物的使用，细菌的耐药性和药物残留现象也随之加重。Zhu D等[6]研究发现，鸭疫里默氏菌具有获得外来基因的能力，包括耐药基因等。Li S等[7]发现鸭疫里默氏菌的RIA_1614基因可以增加其对链霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物的抗性，同时可以提高其对有机溶剂的耐受性。1993年，荷兰学者DE等[8]使用疫苗很好地解决了农场鸭疫里默氏菌病泛滥的问题。因此，疫苗的研制依然是控制该病的重要方法。本文就鸭疫里默氏菌病疫苗的应用现状和展望进行综述。

1 鸭疫里默氏菌病疫苗的应用现状

1.1 灭活疫苗

灭活疫苗一般是利用培养好的菌株，加热或者用化学剂(福尔马林等)将其灭活，即灭活疫苗可能由整个菌体或者病毒组成，也可能由它们的裂解片段组成。灭活疫苗是当前预防和控制鸭疫里默氏菌病用的最多的疫苗，主要包括福尔马林灭活苗、油乳剂灭活苗、氢氧化铝胶灭活苗、蜂胶灭活苗和多价苗等。

1.1.1 福尔马林灭活苗 早在1979年，学者E G Harry和J R Deb就开始研制福尔马林灭活疫苗，随后分别在实验室和野外对3周龄的雏鸭进行免疫接种，取得了较好的免疫效果[9]。1979年-1984年间，英国和美国的一些学者也开始研制福尔马林灭活疫苗并进行了实验室和野外试验，取得了比较满意的临床效果。1987年，张大丙等[5]从北京、广东等病死鸭中分离得到血清1型鸭疫里默氏菌，研制出福尔马林灭活苗和福尔马林超声灭活苗，分别进行了实验室和野外试验。结果显示，疫苗保护率在86.67%～100%，保护效果良好。

1.1.2 油乳剂灭活苗 1988年，德国学者Floren U等研究了油乳剂灭活疫苗，并做了免疫保护试验。随后，高福等[10]试制鸭疫里默氏菌双相油乳剂疫苗，首免8日龄雏鸭，22日龄攻毒，保护率达到91.67%，而且相对于之前的两种福尔马林灭活疫苗用量减少一半。程龙飞等[11]使用血清型1型和2型鸭疫里默氏菌分离株各6株，将细菌培养到一定数量后(1.0×107CFU)，腿部肌肉注射19日龄樱桃谷鸭，筛选出1和2型各3株毒力较强的鸭疫里默氏菌菌株，研制出油乳剂灭活疫苗，首免5日龄樱桃谷鸭，14日龄攻毒(每个血清型不同菌株之间都进行攻毒处理)，各找到1株对其他菌株具有90%保护率的菌株，该菌株可以作为制备疫苗的理想的菌株。

1.1.3 氢氧化铝胶灭活苗 1989年，日本学者Timms L M等[12]研究了鸭疫里默氏菌血清型G型(对应血清型2型)的氢氧化铝胶灭活苗，试验证明，在免疫后14 d保护效果最佳。1996年，泰国学者Pathanasophon P等[13]利用鸭疫里默氏菌肉汤培养液研制氢氧化铝胶灭活苗，设计了不同疫苗浓度梯度试验、免疫后不同时间间隔攻毒试验和不同血清型之间交叉保护的试验。结果表明，正常浓度与两倍正常浓度梯度的疫苗保护率之间没有明显差别，但是与稀释10倍、100倍和1000倍的保护率差异性显著；7日龄进行首免的雏鸭，分别在14、21日龄和2、4、6月龄攻毒。结果显示，在免疫该疫苗后14日龄保护率最高，保护指数(protection index，PI)为95.6。2002年，邓舜洲等[14]通过培养鸭疫里默氏菌2型研制出氢氧化铝胶灭活苗，于5日龄首免樱桃谷鸭，5 d、10 d、15 d的攻毒试验证明，该疫苗的保护率达到50%～60%，25日龄进行二免，5 d后攻毒，保护率达到91.7%。

1.1.4 添加免疫增强剂的灭活苗 在疫苗研制生产过程中，还有添加各种佐剂作为非特异性免疫增强剂来增强疫苗的免疫效果。蜂胶是一种传统的天然药物，富含大量多酚和黄酮类物质。在畜牧生产方面，在日粮中适量添加蜂胶可以增加动物机体的免疫力，提高动物产品的产量和质量。蜂胶的免疫增强作用最早是苏联学者提出来的。我国首先将蜂胶应用到动物疫苗的是禽巴氏杆菌(C48-1菌株)蜂胶灭活苗，其保护率达到100%。蔡家利用鸭疫里默氏菌分离株制备的鸭疫里默氏菌蜂胶灭活疫苗保护效果良好，且雏鸭注射部位没有出现结节、红肿等现象。魏光河等[15]通过设计不同分组研究蜂胶多糖复合佐剂苗的免疫效果。结果证明，注射高浓度蜂胶多糖复合佐剂苗(1∶2)的组，产生抗体的时间最早，与其他组相比，抗体滴度最高，持续时间最长。

黄芪多糖作为一种常见的中药提取成分，安全性高，有助于提高动物机体免疫力，增强机体抗病能力。金尔光等[16]以鸭疫里默氏菌1型分离株为菌株，添加黄芪多糖佐剂，研制出灭活疫苗，于5日龄首免雏鸭，在第3、7、10、14、21天时攻毒，其保护率分别为100%、90%、100%、100%、90%；利用琼脂扩散法检测发现，雏鸭从第3天开始就出现鸭疫里默氏菌的抗体，第10天时抗体滴度达到高峰，而且以黄芪多糖为佐剂的鸭疫里默氏菌灭活疫苗近7倍剂量颈部皮下注射5日龄樱桃谷鸭，未见异常反应。

1.1.5 多价灭活菌苗 鸭疫里默氏菌病在临床上难以控制和预防的原因是其血清型种类多且各个血清型之间没有交叉保护，在临床上的某些症状又容易和大肠杆菌病和沙门氏菌病混淆，同时还与大肠埃希氏菌和沙门氏菌有交叉感染、继发感染等，所以有学者将鸭疫里默氏菌的流行血清型放在一起研制多价苗。

多价灭活菌苗最早是1979年，美国学者Sandhu T S[17]根据当时流行的1、2和5型研制出三价福尔马林灭活苗和氢氧化铝胶灭活苗，并在实验室试验中给10日龄和17日龄的雏鸭接种，攻毒后第2周和4周依然有良好的保护效果；将免疫后的雏鸭放养在野外，保护期可长达7周；该试验还证明不加氢氧化铝胶的疫苗有更好的免疫效果。谢永平等[18]使用鸭疫里默氏菌1、2和3型血清型研制鸭疫里默氏菌油乳剂三价灭活疫苗，颈部皮下注射于7日龄樱桃谷鸭，7 d后保护率为60%，15 d保护率达到100%，免疫期持续到42 d；ELISA检测显示，动物体内抗体从50 d开始出现下降，该实验还证明鸭疫里默氏菌病具有明显的日龄抗性的特点。程龙飞等[19]使用血清型2和11型鸭疫里默氏菌分离株制备二价油乳剂灭活疫苗，皮下接种7日龄番鸭，并在首免后每隔7 d用ELISA法检测血清总抗体水平。结果表明，首免后14 d开始产生抗体，28 d左右体内抗体水平达到峰值，该疫苗保护率超过80%，最高可以达到91.3%，且血清中抗体可以持续2个月。

多价灭活菌苗安全性高，易于保存，无污染危险，对母源抗体的中和作用不敏感，容易制成联苗或多价苗。在添加了佐剂或免疫增强剂的疫苗中，蜂胶灭活疫苗安全性最高，刺激免疫个体产生免疫应答的时间最早，但是免疫期较短。油乳剂灭活疫苗的保护率最高，经过两次以上的免疫，其保护效果可以达到91.3%，体内抗体可以持续2个月。但是根据相关文献报道，注射油乳剂疫苗的部位，皮肤可能出现红肿、结痂现象，故其安全性不及蜂胶灭活苗。灭活疫苗刺激的免疫反应以体液免疫为主，对细胞外病原微生物能产生良好的抵御效果，但是不能激活机体产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)应答，且灭活疫苗中抗原成分不高，所以保护力不及弱毒疫苗，需要加大剂量且多次免疫才能刺激机体产生长久的免疫力。

1.2 减毒活疫苗

活疫苗是指在人工条件下使病原体减毒或者从自然界筛选出无毒株或弱毒株制成的活的微生物制剂。由于灭活疫苗存在以上不足，故早在1984年，Layton H W等[20]就利用体外培养的血清型1、2和5型鸭疫里默氏菌菌株，处理后皮下注射免疫雏鸭，可以保护70%～85%的雏鸭不受以上3种血清型的侵袭，而未免疫的空白对照组雏鸭死亡率达90%～100%。将细菌培养物稀释1/5，保护率仍高于80%。该实验室在长岛养鸭场的实地研究表明，使用该细菌培养物免疫雏鸭，死亡率显著降低。Sandhu T等[21]利用美国当时流行的血清型1、2和5型鸭疫里默氏菌制作活疫苗，通过口服或气雾剂的途径免疫1日龄和7日龄北京鸭，分组观察14 d、28 d、42 d。结果表明，单一血清型活疫苗对感染这一血清型鸭疫里默氏菌的雏鸭有很好的保护率，但对其他血清型没有很好的保护率(0～52%)，且无论用什么途径进行活疫苗免疫，联合血清型1、2和5型的三价活疫苗对感染以上3种血清型鸭疫里默氏菌的雏鸭均有良好的保护率(68%～100%)。

显然，活疫苗的优点是免疫次数少、抗体产生时间长、抗体滴度高，同时可以减轻动物因注射疫苗产生的应激反应，保证动物胴体品质。但由于活疫苗中含有的抗原就是病原微生物本身，所以临床可能会出现毒力返祖的现象，因此在活疫苗研制时和投入使用前，需要进一步确证。

1.3 菌体成分疫苗

菌体成分疫苗又分为亚单位疫苗和基因工程疫苗。由于鸭疫里默氏菌血清型种类多，各个血清型之间没有交叉保护，且同一血清型的不同菌株其毒力也不尽相同，研制的多价苗或者单价苗若是与当前地区流行菌株的血清型不同，也无法起到良好的保护作用，故研制鸭疫里默氏菌的亚单位疫苗就显得尤为重要。

国内外学者对鸭疫里默氏菌亚单位疫苗的研制做了大量工作。亚单位疫苗重点集中在菌体成分和细菌荚膜上。林世棠等[22]通过培养血清1型鸭疫里默氏菌分离株，用十二烷基硫酸钠(SDS)提取细菌的亚单位成分研制疫苗，首免7日龄的番鸭，试验组的平均保护率为92.5%，保护指数87.5，相对于只有60%存活率的对照组，提取的菌体亚单位成分对雏鸭具有很好的保护效果。TonB依赖性受体是活跃在革兰氏阴性菌外膜的转运蛋白家族，主要是帮助细菌吸收铁离子和协助锰、VB12和碳水化合物的运输。但TbdR1(TonB-dependent receptor 1)除了转运功能以外，还是一个毒力因子，在血清型1、2、10型的鸭疫里默氏菌中，是具有交叉免疫原性的抗原。罗雅莉等[23]利用鸭疫里默氏菌DSM15868 株的TbdR1的序列生物学信息，分两段表达TbdR1的抗原表位，构建表达载体，将重组蛋白表达和纯化后用弗氏完全佐剂乳化，皮下注射2日龄雏鸭，免疫18 d后，用10倍LD50的剂量攻毒。结果表明，两个单一蛋白片段均对雏鸭有一定的保护作用，两个片段同时免疫时保护率达到50%。除了TbdR1外，还有OmpA、CAMP cohemolysin、VapD和Sip(siderophore-inferacting)毒力因子。Li T等[24]最近发现，M949-RS00050基因也与鸭疫里默氏菌的毒力有关。Subramaniam S等[25]发现OmpA基因是鸭疫里默氏菌外膜上与其毒力相关的基因，表达产物分子质量为42 ku，它也是鸭疫里默氏菌感染宿主很重要的一个抗原物质，与鸭疫里默氏菌各种血清型无关。也有研究表明，毒力因子CAMP cohemolysin在血清型1、2、3、5、6和19型鸭疫里默氏菌菌株中都有表达，Sip在鸭疫里默氏菌铁摄取系统中有重要作用，与细菌的毒力大小有重要联系，此发现将为以后研究鸭疫里默氏菌亚单位疫苗克服不同血清型之间无交叉保护的弊端提供理论依据。

亚单位疫苗中没有细菌的核酸成分，安全性高，虽然有些细菌血清型较多，血清型之间没有交叉保护，但是由于菌体成分上决定细菌毒性的基因序列是相同的，因此利用这个特点可以改善普通疫苗保护率低和克服使用弱毒疫苗时不能使用抗生素的问题。但是亚单位疫苗相对于其他类型的疫苗，研制成本较高，在市场上推广较困难，因此亚单位疫苗的研究进展受到了限制。

1.4 联苗

联苗是由两个或多个灭活的生物体或者提纯的抗原联合配制而成，用于预防多种疾病。1985年，Sandhu T S和Layton H W[26]研制出O78大肠杆菌和鸭疫里默氏菌二联苗，在2周龄和3周龄的北京鸭上接种后进行实验室和野外试验，结果证明该疫苗可以保护雏鸭不受强毒O78大肠杆菌和血清1型、2型和5型鸭疫里默氏菌的感染。刘晓文等[27]研制了鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus disease，DTMUV)、鸭源大肠埃希氏菌和鸭疫里默氏菌三联苗，选取的分别是鸭坦布苏病毒GDNS2010.1株、鸭源大肠埃希氏菌O1株和鸭疫里默氏菌2型。于10日龄首免麻鸭，随后在31日龄二免和100日龄三免。结果显示，免疫一次，三联苗对大肠埃希氏菌和鸭疫里默氏菌攻毒的保护率为70%和60%，二免的保护率均为90%，三免则达到100%。因此，临床上可以根据实际情况对蛋鸭、雏鸭进行三次免疫，即可达到良好的免疫效果。除了以上用不同细菌的培养物制作灭活联苗之外，也有利用细菌原生质体融合技术构建细菌的多型融合子，这样可以克服鸭疫里默氏菌血清型多且没有交叉保护的问题，也能将不同细菌的免疫原性物质集中在同一个细菌上，这对鸭疫里默氏菌疫苗的研制具有极大的启发作用。王春平等[28]利用鸭疫里默氏菌和鸭大肠埃希氏菌的优势血清型 TXRA1和ZBO78进行融合试验，培育出耐药标记菌株鸭疫里默氏菌TXRA1(Chlr，Erys)和鸭大肠埃希氏菌ZBO78(Eryr，Chls)融合菌株，这为以后鸭疫里默氏菌联苗的研制奠定了基础。

除以上几类疫苗外，Wu H C等[29]研究了传统的灭活疫苗与使用DNA和蛋白质亚单位疫苗(DNA+蛋白质亚单位、蛋白质亚单位+蛋白质亚单位、蛋白质亚单位+灭活疫苗、DNA+DNA)的免疫方案。结果表明，与灭活疫苗相比，DNA+蛋白质亚单位疫苗诱导的抗体水平更高，显著提高了CD8+细胞毒性T细胞的比例，并使IFN-γ、IL-6和IL-8 mRNA的表达水平升高，且以DNA为主要成分的疫苗用来免疫和加强免疫，可以诱发强烈而长期的免疫反应；随着重组DNA技术的出现和疫苗学研究的最新进展，使用DNA+蛋白质亚单位的疫苗有望被广泛用于预防鸭疫里默氏菌病。蛋白质亚单位疫苗往往引起抗体高水平，而表达内源性抗原的DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫反应，使用DNA+蛋白质进行免疫接种后不仅可以预防细菌性疾病，还可以有效地预防病毒性疾病。

2 展望

近几年来看，我国鸭疫里默氏菌病严重影响养鸭业的发展，并因此造成了较大的经济损失。由于鸭疫里默氏菌病经常与大肠杆菌病合并发生，故给该病的确诊带来一定困难。鸭疫里默氏菌的血清型复杂多样，不同地区流行的血清型可能大不相同，且各个血清型之间没有交叉保护作用，这些也给该病的防治带来极大的难度。所以，为了更好地预防和控制该病，应当找到一种临床鉴别该病的快速诊断方法，以便更加高效和快速地诊断出该病。同时，在研究灭活疫苗或者减毒活疫苗时，要从各个地区流行的血清型中找到毒力较强的菌株，从而研制出安全、高效、可以重复使用的多价苗，以打破普通单价疫苗保护机体的单一性，从而更好地预防鸭群的鸭疫里默氏菌病。随着基因组学、蛋白组学等技术的快速发展，鸭疫里默氏菌的相关毒力基因或者免疫原性基因被相继发现，也能推动有关菌体成分疫苗的研究，有望在生产实践中得以更好地应用。