超声辅助提取突隔梅花草多糖的工艺优化及抗氧化活性研究

刘 庆，李化强，吴菲菲，王美英 ，彭 洁，胡 平

(1. 邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000； 2. 广东石油化工学院 生物与食品工程学院，广东省教育厅食品科学创新团队/广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东 茂名 525000)

突隔梅花草(ParnassiadelavayiFranch.)，别称肺心草[1]，形态结构见图1[2]，为虎耳草科梅花草属，对光照和土壤条件要求较低，能在海拔1 800～3 800 m的林下生长迅速，主要产于湘、滇、川等地。 突隔梅花草具有清热润肺，消肿止痛等作用，传统中医将其用于治疗肺痨等疾病[3-4]，研究表明肺结核患者病情的严重程度与体内氧化-抗氧化作用失衡程度有关，抗氧化活性物质在治疗肺结核过程中起着重要作用[5-7]。但是，目前对突隔梅花草的药用成分及活性机制研究较少，仅陈珊[8]、吴丁[9]和Yang等人[10]对突隔梅花草传粉、叶表皮以及物种鉴别进行了研究，未涉及抗氧化物质的提取和活性检测。因此，为了进一步的研究与开发突隔梅花草，本研究从突隔梅花草中提取多糖，采用响应面法优化突隔梅花草多糖的超声辅助提取工艺，并测定体外抗氧化活性，为突隔梅花草开发成保健食品和药品提供理论依据。

图1 突隔梅花草Fig. 1 P. delavayi

1 材料与仪器

1.1 材料

突隔梅花草，购于邵阳市宝庆大药房；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，纯度97%，生工生物工程上海股份有限公司)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS，纯度98%，生工生物工程上海股份有限公司)；其余试剂为实验室常用分析纯试剂。

1.2 仪器

ZN-1000A高速万能粉碎机(中南制药机械厂)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；UV-1780紫外分光光度计(日本岛津仪器有限公司)；VELOCITY 14R台式高速冷冻离心机(南京博惠科学仪器有限公司)。

2 方 法

2.1 样品的制备

将干燥的突隔梅花草的茎叶(含水量<5%)粉碎过40目筛孔，参照Zhu等人[11]的方法，称量4.00 g突隔梅花草于250 mL锥形瓶中，加入蒸馏水，调节pH为6.5～7.5，在不同条件下进行超声，将提取液以11 000 r/min离心10 min，收集上清液，并真空抽滤去除不溶性残余物。将上清液浓缩，4℃下醇沉12 h，以7 000 r/min离心10 min，取沉淀物50℃烘干至恒重，得到多糖。计算多糖得率：

其中m0为干燥的多糖重量(g)；m为干燥的原料重量(g)。

2.2 单因素试验

以液料比、超声时间、超声功率、超声温度为考察因素，其中液料比：10、15、20、25、30 mL/g；超声时间：20、40、60、80、100 min；超声功率：120、150、180、210、240 W；超声温度：30、40、50、60、70℃。以突隔梅花草多糖得率为指标，进行单因素试验。

2.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，采用响应面进行优化试验，响应面设计见表1。

表1 响应面因素与水平Table 1 Response surface factors and levels

2.4 突隔梅花草多糖抗氧化活性的测定

2.4.1 Fe3+还原力的测定

参照杨硕等人[12]的方法，以抗坏血酸(VC)作阳性对照，检测不同浓度突隔梅花草多糖样品液的还原力，按照下式计算：

还原力=Ai-A0

式中：Ai为样品反应后的吸光度；A0为空白对照的吸光度。

2.4.2 DPPH·清除能力的测定

参照姜洪芳等人[13]的方法，以VC作阳性对照，检测不同浓度突隔梅花草多糖样品液的DPPH·清除能力，按照下式计算：

式中：A0为空白对照的吸光度；Ai为样品反应后的吸光度；Aj为无水乙醇代替DPPH的吸光度。

2.4.3 ABTS+·清除能力的测定

参照Chen[14]的方法，以VC作阳性对照，检测不同浓度突隔梅花草多糖样品液的ABTS+·清除能力，按照下式计算：

式中：A0为空白对照的吸光度；Ai为样品反应后的吸光度；Aj为蒸馏水代替ABTS工作液的吸光度

2.4.4 ·OH清除能力的测定

参照曹稳根等人[15]的方法，以VC作阳性对照，检测不同浓度突隔梅花草多糖样品液的·OH清除能力，按照下式计算：

式中：A0为空白对照的吸光度；Ai为样品反应后的吸光度；Aj为蒸馏水代替双氧水溶液的吸光度。

2.5 数据分析

所有试验均平行3次，用SPSS 19.0软件分析显著性和计算IC50，用Design Expert 10软件进行响应面设计与分析，用Origin 2017软件绘图。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 液料比对多糖得率的影响

如图2a所示，在超声时间60 min、超声温度50℃、超声功率150 W的条件下，多糖得率呈先增大后趋于平缓的趋势，液料比20 mL/g与25 mL/g相比差异不显著，因此，选择液料比为20 mL/g。

3.1.2 超声时间对多糖得率的影响

由图2b可知，随超声时间的增加，多糖得率变化呈倒钟形，可能是由于长时间的提取引起了多糖的降解[16]，从而超声时间超过60 min后多糖得率降低，超声时间60 min与40 min、80 min相比差异显著。因此，最佳超声时间为60 min。

3.1.3 超声功率对多糖得率的影响

从图2c中可以看到，随着超声功率的增加，多糖的得率呈先增大后下降的趋势，当超声功率为150 W时，得率最大(4.97%)。可能因为随着超声功率的增大细胞破碎，使多糖溶出率增大，但当超声功率超过150 W时，功率过大使多糖分解，因此最佳提取功率为150 W。

3.1.4 超声温度对多糖得率的影响

如图2d所示，在超声温度30～70℃范围内，多糖得率显著增加随后趋于平缓，这可能是由于温度升高，分子动能增大，使得多糖溶出率增大，但温度超过60℃时，多糖溶出率趋于平衡。因此，选择60℃为最佳超声温度。

图2 液料比(a)，超声时间(b)，超声功率(c)和超声温度(d)对多糖得率的影响Fig. 2 The effect of liquid material ratio (a), ultrasonic time (b), ultrasonic power (c) and ultrasonic temperature (d) on the yield of polysaccharide 注：同一柱状图中不同字母表示组间差异显著(P<0.05)

3.2 响应面优化试验

3.2.1 响应面试验结果

通过单因素试验，进行4因素3水平响应面试验，结果见表2，方差分析结果见表3，响应面曲面图见图3。

突隔梅花草多糖得率(Y)对超声温度(A)、超声时间(B)、超声功率(C)和液料比(D)的二次多项回归模型：Y(%)=5.52+0.49A+0.10B+0.022C+0.37D-0.10AB-0.089AC+0.092AD-0.020BC-0.072BD-0.020CD-0.23A2-0.11B2-0.30C2-0.22D2

表2 多糖提取工艺响应面设计及结果Table 2 Response surface design and resultsof polysaccharide extraction experiments

续表2 多糖提取工艺响应面设计及结果Table 2 Response surface design and resultsof polysaccharide extraction experiments

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance of regression model

3.2.2 最佳工艺条件的预测与验证

通过响应面试验得到最佳提取条件：液料比25 mL/g，超声时间53.57 min，超声温度70℃，超声功率145.89 W，多糖得率的预测值为6.03%。根据实际情况进行调整，调整后条件：液料比25 mL/g，超声时间54 min，超声温度70℃，超声功率147 W，多糖得率的试验值为6.01%，相对误差为0.32%，表明优化的工艺参数可靠。

3.3 突隔梅花草多糖抗氧化活性测定结果

3.3.1 Fe3+还原力的测定

突隔梅花草多糖的Fe3+还原力见图4a。在Fe3+还原力测定中，吸光度越大，还原力越强。在0～1.00 mg/mL的浓度范围内，突隔梅花草多糖和VC质量浓度与铁还原力与成正比，但突隔梅花草多糖的铁还原力低于VC。

图3 各因素响应面分析图Fig. 3 Response surface analysis diagram of each factor注：A.超声温度；B.超声时间；C.超声动率；D.料液比

3.3.2 DPPH·清除能力的测定

突隔梅花草多糖的DPPH·清除能力见图4b。在0～100 μg/mL的浓度范围内，随着浓度的增加，突隔梅花草多糖对DPPH·的清除能力随之增加。当浓度为20 μg/mL时，VC对DPPH·的清除能力接近100%，说明VC的纯度良好。当浓度为100 μg/mL时，突隔梅花草多糖对DPPH·清除能力达到76.82%，其IC50为39.18 μg/mL。

田崇梅[17]和何念武等人[18]采用超声辅助提取技术分别提取了蒙古黄芪多糖和灰灰菜多糖，并研究了提取物对DPPH·的清除能力。结果表明，IC50分别为1.14 mg/mL和1.899 mg/mL，可以比较出突隔梅花草多糖的DPPH·清除能力较好，这可能由于突隔梅花草具有清热润肺，治疗肺结核作用[3]，从而抗氧化效果良好。

3.3.3 ABTS+·清除能力的测定

突隔梅花草多糖的ABTS+·清除能力见图4c。在0～100 μg/mL的浓度范围内，突隔梅花草多糖对ABTS+·的清除能力呈上升趋势。当浓度为25 μg/mL时，突隔梅花草多糖对ABTS+·的清除能力接近VC，达到94.22%，IC50为11.68 μg/mL。

庞丹清[19]和熊磊[20]等人对超声辅助提取技术提取的当归藤多糖和黄金茶多糖的ABTS+·清除能力进行了研究，发现IC50分别为0.03 mg/mL和0.55 mg/mL，可能由于突隔梅花草多糖与其他活性成分如蛋白质，脂类等轭合，形成了多糖轭合物[21]，从而ABTS+·清除能力高于当归藤多糖和黄金茶多糖。

3.3.4 ·OH清除能力的测定

突隔梅花草多糖对·OH清除能力见图4d。在2～10 mg/mL的浓度范围内，突隔梅花草多糖对·OH清除能力呈良好的线性关系，当浓度为10 mg/mL时，突隔梅花草多糖对·OH清除能力达到95.35%，其IC50为4.15 mg/mL。

曹叶霞等人[22]采用超声辅助提取技术提取了黑枸杞多糖，并测定了提取物对·OH的清除能力，IC50为6.00 mg/mL，说明突隔梅花草多糖具有良好的·OH清除能力，可能由于突隔梅花草多糖碳氢链上的氢原子较多，可以与·OH结合生成水[21]，从而·OH清除能力较好。

图4 突隔梅花草多糖的抗氧化活性Fig. 4 Antioxidant ability of P. delavayi polysaccharides注：a.Fe3+还原力；b.DPPH·清除能力；c.ABTS+·清除能力；d.·OH清除能力

4 结论与讨论

本研究从突隔梅花草中提取多糖，并采用响应面法优化超声辅助提取工艺，得到最佳提取工艺：液料比25 mL/g，超声时间54 min；超声温度70℃，超声功率147 W。通过验证试验得到的实际得率为6.01%。

与蒙古黄芪多糖、灰灰菜多糖相比，突隔梅花草多糖的DPPH·清除效果具有优势；ABTS+·的清除能力也高于当归藤多糖、黄金茶多糖；同时也具有优于黑枸杞多糖的·OH清除效果。说明突隔梅花草多糖具有开发成为保健食品和药品的潜力。

多糖的抗氧化作用主要与多糖的组成、结构以及分子量等相关[21]，后续将对多糖的组成、结构进行进一步的研究，为突隔梅花草多糖开发成为保健食品和药品提供理论依据。