河谷地不容3个O-甲基转移酶原核表达及生物信息学相关分析

刘曼玉，赵万里，刘吉华

(中国药科大学 江苏省中药评价与转化重点实验室，江苏 南京 211198)

河谷地不容(StephaniaintermediaLo)为防己科千金藤属植物，含有多种类型的苄基异喹啉类生物碱(Benzylisoquinoline alkaloids，BIAs)，如具有镇痛作用的四氢巴马汀及紫堇达明、抗菌药效的小檗碱及抗肿瘤作用的金黄紫堇碱等[1-5]。目前BIAs主要从药用植物中提取获得，多为微量成分，自然资源有限，如紫堇达明在河谷地不容中的含量仅为0.038～3.42mg/g[6]。此外，BIAs具有稠环结构且多数化合物具有手性中心，该类化合物化学合成路线复杂、手性拆分困难且对环境不友好。因此BIAs的来源严重制约其进一步的开发和临床应用。

合成生物学的迅速发展为天然药效物质的生物技术制备提供了新的策略，解析高活性天然成分的生物合成途径及其关键酶是实现异源生物合成的基础。课题组前期对河谷地不容中BIAs生物合成途径下游的部分甲基转移酶进行了鉴定和功能验证[7]，但是河谷地不容中BIAs生物合成途径上游的关键酶还有待阐明。甲基转移酶可将供体S-腺苷L-蛋氨酸的甲基转移至受体上，从而形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基化分子[8-9]。甲基化在植物次生代谢中起着中心作用，它能引导中间体进入特定的生物合成途径[10-11]。O-甲基转移酶参与生物碱生物合成后的甲基化修饰过程，极大丰富了生物碱的种类。

多数BIAs共用一个上游合成途径，如吗啡、小檗碱、血根碱[12]。这几种生物碱共同的生源合成途径以酪氨酸为前体物质，经过多步酶催化反应生成这些化合物的一个共同中间体牛心果碱。去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(norcoclaurine 6-O-methyltransferase，6OMT)是BIAs生物合成中催化发生甲基化的第一个酶，催化去甲乌药碱的C-6位羟基的甲基化[12]；3′羟基-N-甲基乌药碱4′-O-甲基转移酶(3′-hydroxy-N-methylcoclaurine-4′-O-methyltransferase，4′OMT)催化3′羟基-N-甲基乌药碱产生牛心果碱。前期研究发现S.intermedia含有丰富而重要的生物碱，因此研究其生物合成途径及其调控具有重要意义。以S.intermedia为材料，克隆获得3个O-甲基转移酶基因Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2(Si表示基因来源于S.intermedia)，对3个O-甲基转移酶基因进行生物信息学相关分析，并分别构建至表达载体pGEX-6P-1中表达蛋白，为BIAs合成途径解析及异源合成积累一定的科学数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

河谷地不容材料来自江苏省中药评价与转化重点实验室。

1.1.2 质粒和菌株

试验中主要质粒和菌株如表1所示。

表1 试验所用质粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this experiment

1.1.3 试剂

氨苄青霉素购自大连美仑生物技术有限公司；考马斯亮蓝快速染液购自上海碧云天生物技术有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)试剂盒、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR mix (2 × Easy Taq mix)购自北京全式金生物技术有限公司；Gflex DNA polymerase购自北京宝日医生物技术有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)为BioSHARP公司产品；植物RNA试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒为Omega Bio-tek公司产品；LB培养基、TB培养基为Mdbio Inc公司产品。

1.1.4 试验仪器

PCR仪(Bio-Rad T100 Thermal Cycler，美国)、电泳系统(Bio-Rad 1645050，美国)、凝胶成像仪(Bio-Rad Universal Hood Ⅱ，美国)；微量分光光度计(Nanodrop100，博克科技有限公司)；超声波细胞粉碎仪(JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司)；恒温摇床(HYL-C，太仓市强乐实验设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

课题组前期对河谷地不容的块根和叶组织部位进行转录组从头测序，通过生物信息学分析，挖掘出参与BIAs合成的基因序列Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2。采用植物RNA试剂盒提取样品总RNA，并对提取的RNA进行逆转录成cDNA，根据cDNA序列设计引物，如表2。采用PCR对cDNA和载体质粒进行扩增(反向扩增的质粒)PCR反应程序：预变性94℃，1 min；变性98℃，10 s；退火57℃，15 s；延伸68℃，1 min；30循环；后延伸68℃，10 min。用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，切胶回收DNA片段。利用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)试剂盒进行同源重组构建质粒，并利用热击法将重组液转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后挑选阳性单克隆进行测序, PCR反应条件：94℃预变性，5 min；94℃变性，30 s；55℃退火，30 s；72℃延伸，1 min；30个循环次数；72℃后延伸，10 min。

表2 河谷地不容O-甲基转移酶基因扩增所用引物Table 2 Primers for amplification of O-methyltransferasegenes in S. intermedia

1.2.2 生物信息学分析

使用NCBI数据库中的ORF Finder查找该基因的开放阅读框；用Blast程序将3个甲基转移酶基因编码的氨基酸序列在GenBank中进行同源性搜索；用Conserved domain finder程序分析3个基因保守结构域；利用DNAMAN软件对不同来源的O-甲基转移酶氨基酸序列进行多重比对[13-14]；利用EXPASY在线工具预测蛋白的理化性质。利用MEGA.5软件，以邻接算法，每个分支的自举频率基于1 000次迭代构建系统发育树[15-16]。用于构建系统发育树的酶的信息见表3。表格中缩写如下：金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶(scoulerine 9-O-methyltransferase，SOMT)、非洲防己碱-O-甲基转移酶(columbamineO-methyltransferase，CoOMT)、牛心果碱-7-O-甲基转移酶(reticuline 7-O-methyltransferase，7OMT)、儿茶酚-O-甲基转移酶(catecholO-methyltransferase，CaOMT)、O-甲基转移酶(O-methyltransferase，OMT)、去甲牛心果碱-7-O-甲基转移酶(norreticuline-7-O-methyltransferase，N7OMT)。

表3 构建系统发育树所用氨基酸序列信息Table 3 Amino acid sequence information usedto construct phylogenetic tree

1.2.3 蛋白的原核表达

从E.coliDH5α菌株中抽提质粒，并分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布于抗性平板上，过夜培养。挑取单菌落，接入5 mL LB培养基中，37℃，220 r/min培养过夜得种子液。将种子液按1%接种量接种至50 mL含有1‰氨苄青霉素抗性的TB培养基中，37℃，200 r/min培养3.5 h(OD600=0.6～0.8)，加入终浓度为0.1 mM IPTG诱导表达，16℃，200 r/min继续培养18 h。

1.2.4 表达蛋白的可溶性检测

取100 mL诱导完毕的菌液分次加入50 mL离心管中，6000 ×g,离心3 min弃上清，沉淀用10 mL pH=7.4 buffer重悬，超声破碎。取100 μL破碎液，12 000 ×g离心5 min，吸取80 μL。沉淀加入1 mL ddH2O重悬离心弃上清，再以80 μL ddH2O重悬。上清和沉淀分别加入20 μL 5×loading buffer，100℃煮沸5 min。制备好的蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后进行凝胶成像。

2 结果与分析

2.1 目的片段的扩增

采用PCR从河谷地不容cDNA中扩增出3个O-甲基转移酶基因，Si4′OMT基因全长948 bp，其中开放阅读框为933 bp，编码311个氨基酸；Si6OMT1基因全长1032 bp，其中开放阅读框为1029 bp，编码343个氨基酸；Si6OMT2基因全长1080 bp，其中开放阅读框为1062 bp，编码354个氨基酸。图1结果显示PCR克隆得到的条带大小与目的基因序列大小一致，条带经切胶回收，用于后续克隆。

2.2 重组质粒的构建

采用同源重组克隆技术将目的基因与载体连接，重组液通过感受态细胞转化，再经过氨苄青霉素抗性平板筛选，获得阳性单菌落。以pGEX5′/pGEX3′引物对挑取的单菌落进行菌落PCR鉴定，电泳图如图2。从菌落PCR结果可以判断目的片段已成功插入至表达载体的克隆位点上，阳性菌落接入LB培养基，过夜培养，取阳性菌液送公司测序，经比对序列正确。

图1 PCR扩增三个甲基转移酶基因Fig. 1 PCR amplification of three methyltransferase genes注：M为2K Marker；1-1和1-2为Si4′OMT；2-1和2-2为Si6OMT1；3-1和3-2为Si6OMT2

图2 阳性单克隆的菌落PCR鉴定Fig. 2 PCR identification of positive monoclonal colonies注：M为2K Marker；1-1至1-5为Si4′OMT；2-1至2-5为Si6OMT1；3-1至3-5为Si6OMT2

2.3 生物信息学分析

2.3.1 氨基酸序列的比对

Si4′OMT基因编码的氨基酸序列与其他植物来源的氨基酸序列的同源性达到60%～70%；Si6OMT1基因编码的氨基酸序列与莲花(Nelumbonucifera)的氨基酸序列相似性最高，可达到72.97%；Si6OMT2基因编码的氨基酸序列与其他植物来源的氨基酸序列的同源性较低，仅达到50%～60%，结果见表4、表5和表6。经蛋白保守域分析可知，3个O-甲基转移酶都含有二聚化结构域，属于S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶超家族(S-adenosylmethionine(AdoMet or SAM)-dependent methyltransferase superfamily, AdoMet_MTases superfamily)。

表4 Si4′OMT与不同植物4'OMT氨基酸的同源性比对Table 4 Homology comparison of amino acids betweenSi4′OMT and 4'OMT in different plants

表5 Si6OMT1与不同植物6OMT氨基酸的同源性比对Table 5 Homology comparison of amino acids betweenSi6OMT1 and 6OMT in different plants

表6 Si6OMT2与不同植物6OMT氨基酸的同源性比对Table 6 Homology comparison of amino acids betweenSi6OMT2 and 6OMT in different plants

2.3.2 蛋白理化性质的分析

为进一步研究3个O-甲基转移酶基因的功能提供理论依据，采用EXPASY在线工具对Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2的基本性质进行分析(表7)。Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2中只有Si6OMT1稳定；经过亲水性分析，Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2的GRAVY值均为负值，即3个蛋白均为亲水性蛋白；通过跨膜分析可知，Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2都没有跨膜区。

表7 三个甲基转移酶蛋白质序列的基本特性Table 7 The basic properties of the proteinsequence of three methyltransferases

2.3.3 系统进化树的分析

通过构建系统进化树可以发现，Si4′OMT形成独立的进化分支，Si6OMT1与来自于S.tetrandra的St6OMT2聚类成同一个进化支。Si6OMT2与来源于S.tetrandra的St6OMT4聚类成同一个进化支，结果如图3。

图3 甲基转移酶系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of methyltransferases注：黑色圆圈标记为克隆的3个O-甲基转移酶，每个进化枝的自举频率基于1 000次迭代。

2.4 工程菌株的诱导与表达

将重组质粒导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行蛋白表达，由于重组蛋白融合了GST标签，重组后实际蛋白大小应加上GST标签的分子量(约26 KDa)。通过计算，Si4′OMT、Si6OMT1、Si6OMT2的蛋白分子量分别约为61.0 KDa、63.9 KDa、65.7 KDa。与空载体蛋白对照相比，3个蛋白的上清部分有明显的条带(如箭头所指)，说明3个蛋白形成可溶性表达(图4)。

3 讨论与结论

前期研究发现6OMT催化的反应是生物碱合成过程中的关键限速步骤之一[17-18]，将源于日本黄连的6OMT基因导入加州罂粟培养细胞中，过表达6OMT的培养细胞产生的生物碱平均含量是野生型细胞的7.5倍[17]。4′OMT也是BIAs生物合成的关键酶，过表达日本黄连中4′OMT基因，使小檗碱的产量增加1.5倍[19]。最近的研究显示，可从黄连(Coptischinensis)[20]、粉防己(Stephaniatetrandra)[18]等植物中克隆获得6OMT基因，从莲花(Nelumbonucifera)[21]中克隆获得4′OMT基因，为研究BIAs合成途径及异源合成提供材料。

图4 重组蛋白SDS-PAGE检测结果Fig. 4 Results of recombinant protein in SDS-PAGE注：M为marker；泳道1为pGEX-6P-1(载体对照)沉淀；泳道2为pGEX-6P-1(载体对照)上清；泳道3为Si4′OMT沉淀；泳道4为Si4′OMT上清；泳道5为Si6OMT1沉淀；泳道6为Si6OMT1上清；泳道7为Si6OMT2沉淀；泳道8为Si6OMT2上清

O-甲基转移酶参与BIAs类生物碱生物合成的后修饰，生物碱结构上加甲基会对其化学性质产生重要影响，从而改变其生物活性。河谷地不容中含丰富的BIAs类活性成分，块根和叶中基本涵盖四氢原小檗碱类生物碱生物合成的主要中间体，且四氢巴马汀和紫堇达明的含量相比于同科属其他药用植物高[6]，推测河谷地不容中可能存在高活性的O-甲基转移酶，因此对其合成通路中的酶进行解析有重要意义。

以河谷地不容为材料，克隆获得3个O-甲基转移酶基因Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2，分别编码311、343、354个氨基酸，生物信息学分析发现，3个基因都含有二聚化结构域，属于AdoMet_MTases超家族，且Si6OMT1蛋白相对于Si4′OMT和Si6OMT2更稳定。Si6OMT1与来源于S.tetrandra的St6OMT2聚类成同一个分支，推测Si6OMT1可能与已报道的St6OMT2有类似的催化特性[18]。

将河谷地不容的3个O-甲基转移酶基因构建至表达载体pGEX-6P-1，采用原核表达体系E.coliBL21(DE3)为宿主进行表达可快速获得目的蛋白，且操作简单、外源基因表达产物的水平较高。表达载体选择N端含有GST标签的质粒pGEX-6P-1，该质粒转录后mRNA中5′端编码GST标签的序列被首先翻译，有效地避免了mRNA无法被核糖体识别和核糖体延伸阻碍的问题，有助于目的蛋白的表达。经SDS-PAGE电泳分离，与空载体对照相比，蛋白上清液在目的片段大小处有条带，说明3个蛋白在大肠杆菌系统中实现了可溶性表达，这将为进一步分析河谷地不容Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2转录因子的下游调控基因打下了基础，为解析河谷地不容中BIAs合成途径解析及异源合成积累科学数据。