剪接因子MBNL3对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响

郝文真，陈杰民，冯云路，吴 晰，王 强，吴 东，杨爱明

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 疑难重症及罕见病国家重点实验室 消化内科，北京 100730)

胰腺癌(pancreatic caner)的治疗效果差、病死率高，预计到2030年，它将成为继肺癌之后第二大癌相关死亡原因[1]。由于早期缺乏特异临床症状和合适的诊断方法，只有20%胰腺癌在进行相关检查时得以诊断[2]。胰腺癌治疗的耐药性也是难以解决的问题[3]。因此，探索胰腺癌发生发展机制，为寻找胰腺癌早期诊断和治疗靶点提供理论基础非常重要。可变剪接在生理过程中发挥重要作用，剪接失调是肿瘤发生的特征之一。肌盲样蛋白(muscleblind-like proteins，MBNL)是一种RNA结合蛋白，可双向调节剪接过程[4]，在癌组织中过表达可能促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[5]。本研究拟探讨MBNL3在胰腺癌组织中表达情况，同时利用体外培养技术敲低或过表达胰腺癌细胞系中的MBNL3基因，观察癌细胞生物学行为和功能的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源：纳入2017年至2020年于北京协和医院行胰腺癌切除的50例胰腺癌患者，获取胰腺癌组织及对应癌旁胰腺组织(距离肿瘤病灶边缘>5 cm)石蜡样本。纳入标准：肿瘤局限于胰腺实质内，无胰腺外侵袭及淋巴结转移，术后病理明确诊断为胰腺癌；术前未接受过放射治疗和(或)化学治疗；排除胰腺细胞不典型增生患者。该研究通过北京协和医院伦理委员会审核批准并豁免知情同意书(伦理审查批件编号：ZS-2698)。

1.1.2 细胞系及主要试剂：人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE、人胰腺癌细胞系ASPC1、BXPC3、CFPAC1和SW1990(中国科学院上海分院细胞库)；RPMI 1640培养基(货号21870076)、胰蛋白酶(货号:15050065)、胎牛血清(货号:10099141)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒(货号:23227)、细胞裂解液(货号:89900)(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白酶抑制剂(货号:ab65621)、兔抗人MBNL3抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体(Abcam公司)；Neofect DNA转染试剂(货号:TF201201)(北京玛因科技有限公司)；免疫组织化学检验试剂盒(货号:GK500705)(Dako公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法：按照试剂盒说明书操作，微波热修复抗原10 min后等待温度自然降至室温，DAB显色90 s。每张切片免疫组化结果均由2位病理科医师双盲评价。根据免疫组化染色着色强度和范围综合评价：1)细胞无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；2)无阳性细胞为0分，阳性肿瘤细胞数占肿瘤细胞总数百分比<10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。将这两项评分的乘积作为最终评分，包括0、1、2、3、4、6、9分。

1.2.2 蛋白质印迹实验：当胰腺癌细胞汇合度达80%时，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(1∶200)，充分裂解后，BCA试剂盒定量变性。蛋白行10% SDS-PAGE。转膜后脱脂奶粉封闭过夜。一抗4 ℃摇床孵育8 h，二抗室温孵育1 h。PBST洗涤后暗室显影，用Image J软件灰度分析蛋白条带。

1.2.3 载体构建与质粒转染：质粒构建与测序鉴定由上海吉玛制药技术有限公司完成。以pcDNA3.1质粒为骨架，携带启动子、新霉素抗性基因、氨苄霉素抗性基因，在HindⅢ和BamHⅠ两处酶切位点剪切后插入人MBNL3基因，构建过表达质粒CMV-HindⅢ-MBNL3-Flag-BamHⅠ和敲低质粒CMV-HindⅢ-shRNA1-MBNL3-BamHⅠ及CMV-HindⅢ-shRNA2-MBNL3-BamHⅠ。采用质粒转染技术，在MBNL3表达水平较高的胰腺癌野生型细胞系ASPC1和SW1990中选择两个位点敲低MBNL3基因表达，在MBNL3表达水平较低的胰腺癌野生型细胞系BXPC3和CFPAC1中过表达MBNL3基因。采用Neofact转染法按照说明书配制体系，将shRNA-control、shRNA1-MBNL3、shRNA2-MBNL3、pcDNA3.1-Flag和MBNL3-Flag分别转染至上述4种胰腺癌细胞系中。

1.2.4 细胞增殖实验：E-Plate检测板使用前用紫外线照射过夜并调零。转染后，细胞计数以3 000个/孔接种于E-Plate检测板，实时无标记动态细胞分析技术(real-time cellular analysis,RTCA)法观察比较各组细胞增殖情况。

1.2.5 平板集落形成实验：转染后的细胞以每孔1 000个/3 mL接种于6孔板。于5% CO2、37 ℃培养10 d后，甲醇固定，结晶紫染色。拍照保存并计数每孔细胞集落形成数目。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：在Transwell小室滤膜上铺2%基质胶100 μL，用于侵袭实验。迁移实验Transwell小室滤膜不铺胶。当细胞汇合度达80%时，用无血清培养基重悬配制成6×105/mL细胞悬液。下室加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基800 μL，上室加细胞悬液100 μL。于5% CO2、37 ℃培养10 h后，甲醇固定，结晶紫染色。普通光学显微镜下观察细胞迁移和侵袭结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MBNL3蛋白在胰腺癌细胞系和组织中的表达

在正常胰腺导管上皮细胞系HPDE和4种胰腺癌细胞系ASPC1、BXPC3、CFPAC1、SW1990中，正常胰腺导管上皮细胞HPDE中无表达，胰腺癌细胞系ASPC1和SW1990中的表达量高于BXPC3和CFPAC1(图1A)。

MBNL3蛋白在胰腺癌组织着色强度和着色范围评分分别为2.8±0.3和2.5±0.6，均显著高于其所对应癌旁组织的1.1±0.6和1.0±0.6(P<0.05)；50例胰腺癌组织中，MBNL3的免疫组化染色评分为5.0±2.7，显著低于癌旁组织的2.1±0.6(P<0.05)(图1B)。

A.protein expression of MBNL3 in pancreatic normal or cancer cell lines; B.protein expression of MBNL3 in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues(×20); *P<0.05 compared with adjacent tissue group图1 MBNL3在正常胰腺上皮细胞系和胰腺癌细胞系、组织中的表达Fig 1 Protein expression of MBNL3 in pancreatic normal or cancer cell lines and pancreatic cancer n=3)

2.2 MBNL3对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭与集落形成的影响

2.2.1 转染后胰腺癌细胞系MBNL3蛋白表达：蛋白印迹法结果显示，与野生型细胞相比，敲低的ASPC1和SW1990细胞中MBNL3蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，而过表达的BXPC3和CFPAC1细胞中MBNL3蛋白表达水平显著上调(P<0.05)(图2A)。

2.2.2 对胰腺癌细胞增殖能力的影响：与对照组相比，72 h内过表达组的胰腺癌细胞增殖曲线高于对照组，而敲低组的胰腺癌细胞增殖曲线低于对照组(图2B)。

A.protein expression of MBNL3 in transfected pancreatic cancer cell lines; B.effects of MBNL3 on proliferation of pancreatic cancer cell lines; *P<0.05 compared with control group图2 转染后胰腺癌细胞系MBNL3表达与增殖Fig 2 Expression of MBNL3 and cell proliferation in transfected pancreatic cancer cell n=3)

2.2.3 对胰腺癌细胞集落形成能力的影响：转染10 d后，过表达组的胰腺癌细胞集落形成体积大，集落数目多(P<0.05)；而敲低组的胰腺癌细胞集落形成体积小，集落数目少(P<0.05)(图3A)。

2.2.4 对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响：与对照组相比，过表达组的胰腺癌细胞穿过Transwell小室膜的数量更多(P<0.05)；而敲低组的胰腺癌细胞穿过Transwell小室膜的数量更少(P<0.05)(图3B,C)。

A.images of MBNL3 knocked down or over-expressed on colony formation of pancreatic cancer cell lines; B.effects of MBNL3 knocked down or over-expressed on migration capacity of pancreatic cancer cells by Transwell assay(×20); C.effects of MBNL3 knocked down or over-expressed on invasion capacity of ASPC1 pancreatic cancer cells by Transwell assay(×20); *P<0.05 compared with control group图3 转染后胰腺癌细胞系集落形成、迁移和侵袭Fig 3 Colony farming, migration and invasion of transfected pancreatic cancer cell n=3)

2.2.5 绘制ROC曲线:根据MBNL3在胰腺癌组织中表达的免疫组化染色总分来绘制ROC曲线，结果提示，以免疫组化总分为预测指标，当得分为3时，曲线下面积最大为0.88，约登指数为0.56(图4)。

图4 基于MBNL3在胰腺癌组织中免疫组化得分的ROC曲线Fig 4 ROC curve based on Immunohistochemistry Score of MBNL3 in pancreatic cancer tissue

3 讨论

MBNL3通过直接或参与调节可变剪接的蛋白质，如替代外显子编码序列[6]、锌指结构[7]、富蛋白元素[8]、下游富含谷氨酰胺区域[9]等调节可变剪接过程，对组织胚胎发育至关重要，表达异常会引起疾病[10]。

本实验结果提示MBNL3过表达可能与胰腺癌发生、发展有密切关系。MBNL3对癌细胞的促进作用在肝细胞肝癌中也有报道[11]。TCGA数据库分析表明，MBNL3表达水平在胰腺癌与正常胰腺组织存在差异，分化差的胰腺癌中其表达水平更高。本研究的MBNL3免疫组化胰腺癌ROC曲线提示，当得分为3时，区别胰腺癌组织与癌旁胰腺组织能力最优，得分高于3时诊断倾向于胰腺癌。有研究对683例胰腺癌血清CEA和CA12-5分析并制作ROC曲线，二者区别胰腺癌的曲线下面积分别为0.89和0.85[12]。另外，数据库分析显示MBNL3过表达对患者无病生存期和总生存期有影响，提示MBNL3有可能作为胰腺癌诊断和预后的潜在生物分子标志物。

本研究纳入的胰腺癌临床病理样本不伴周围侵袭、没有淋巴结与远处转移，发现MBNL3蛋白表达水平与胰腺癌恶性生物学行为有密切关系，初步表明MBNL3有可能作为胰腺癌早期诊断或生物治疗的分子标志物。本研究的不足之处是纳入样本较少，仍需要大批量组织样本进行验证。有望通过血清学检测来探究MBNL3在早期诊断和预后检测中的诊断效能和应用价值。

总之，本研究初步揭示了MBNL3在促进胰腺癌细胞侵袭和转移中的作用。有关MBNL蛋白家族的研究对寻找胰腺癌早期诊断和生物治疗提供新的分子靶标具有重要意义。