血管生成素样蛋白3基因敲低减轻胸主动脉瘤的发生和发展

于华惠，焦晓璐，杨云云，李 凡，孙秋菊，玉 钰，吕倩雯，秦彦文

(首都医科大学附属北京安贞医院；北京市心肺血管疾病研究所上气道功能障碍相关心血管疾病北京重点实验室，北京 100029)

胸主动脉瘤(thoracic aortic aneurysm，TAA)是以胸主动脉异常扩张为主要病变的一类疾病[1]，为心血管急危重症，发病急剧、病死率高、预后差，临床通常表现为急性胸痛[2]。未经治疗的TAA，在发病后前48 h的存活率仅有1%。即使进行治疗，病死率仍为50%[3]。目前临床上只能通过手术治疗，没有有效的药物控制可延缓TAA的发生发展。因此，需要寻找有效的治疗靶点来减缓TAA的发展以降低TAA破裂的风险。

血管生成素样蛋白(angiopoietin-like proteins, ANGPTLs)家族是一类分泌蛋白，参与多种心血管疾病的发生和发展[6-7]。ANGPTL3是ANGPTLs家族的主要成员之一，在心血管疾病中起重要作用[8]。在小鼠中ANGPTL3单克隆抗体显著减少了动脉粥样硬化病变面积与脂质坏死核心[9]。人体给予ANGPTL3反义寡核苷酸6周，致动脉粥样化的脂蛋白水平降低[10]。除了其在脂代谢中的作用外，该分子还具有促炎和促血管生成作用[11]。ANGPTL3单克隆抗体已进入临床三期试验[12]，是治疗心血管疾病的新靶点。但截止目前的研究还未报道ANGPTL3是否在TAA中发挥作用。本文研究了ANGPTL3在TAA中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人体标本收集：本研究纳入了术前计算机断层扫描(computed tomography, CT)后接受TAA常规手术的患者，所有患者均无结缔组织病。对照组主动脉组织样本是从北京安贞医院的心脏移植供体中获得的。所有参与者在入组前均给予书面知情同意。该议定书经北京安贞医院医学伦理委员会证实，并符合《赫尔辛基宣言》。本研究已在中国临床试验注册(伦理审批号：ChiCTR-COC-17010792)。

1.1.2 动物：SPF级3周龄雄性C57BL/6小鼠(北京市华阜康生物科技有限公司No.110364201100066868)。所有动物的使用均遵循美国健康国立研究所出版的实验动物照料和使用指南和首都医科大学实验动物照料和使用规则。

1.1.3 细胞与试剂：人主动脉平滑肌细胞(human artery smooth muscle cell,HASMC)(上海信裕生物科技有限公司)；β-氨基丙腈 (β-amino-propionitrile mono-fumarate，BAPN)和抗体IL-1β(Sigma-Aldrich公司)；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒 (Roche公司)；基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)(Santa Cruz公司);基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP2)、ANGPTL3、GAPDH(Abcam公司); 二抗(CST公司)和辣根过氧化物酶标记免疫组化二抗(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 BAPN诱导小鼠胸主动脉瘤模型：将小鼠随机分为对照组(n=15)和主动脉瘤(TAA)模型组(n=15)。每天喂以新鲜配制并溶解在饮用水中的BAPN(1 g/kg)，28 d后收取小鼠组织。

1.2.2 免疫组化检测血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、白介素6(IL-6)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达：石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸钠(pH=6.0)抗原修复，内源性过氧化物酶抑制剂20 min。PBS洗3次，各3 min。血清封闭30 min后，吸去血清，加入相应一抗，4 ℃湿盒过夜。次晨取出湿盒室温放置30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，各3 min。滴加辣根过氧化物酶标记二抗室温1 h，PBS洗3次，各3 min。DAB 显色。使用配备DS-Ri2彩色CCD的Ni-UNikon立式显微镜获得图像后，用 Image-J 软件分析。

1.2.3 HASMCs的培养及转染：将HASMCs培养于含有10%胎牛血清FBS及1%的青霉素/链霉素DMEM培养基中，置于含有5% CO2、37 ℃孵箱。将细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，siRNA组加入ANGPTL3 siRNA(10 μg)和转染试剂(10 μL)后培养，24 h后换液为完全培养基。将细胞分为：对照组、ANGPTL3siRNA(10 μg)组、AngⅡ(100 nmol/L)组和AngⅡ +ANGPTL3siRNA组。

1.2.4 RT-qPCR检测Bax、Bcl-2的mRNA表达水平：Trizol法提取细胞RNA。使用Nanodrop 2000测定细胞RNA浓度。将mRNA反转录为cDNA后，分别加入2×SYBR GREEN PCR Master Mix 10 μL、RNase Free H2O 9 μL和上下游引物各0.5 μL，总反应体系为20 μL。混匀后加入到上述各管中，使用带有SYBR Green I的iQ5系统用于实时qPCR。通过在95 ℃孵育5 min，然后在95 ℃进行45 s和60 ℃进行60 s的45个循环来扩增样品。管家基因GAPDH用作对照。相对mRNA水平使用2-ΔΔCt方法计算，并标准化为GAPDHmRNA水平。引物序列分别为：Bax:上游引物：5′-TGAAGACAGGGGC CTTTTTG-3′，下游引物：5′-AATTCGCCGGAGACAC TCG-3′；Bcl-2:上游引物：5′-GTCGCTACCGTCGTG ACTTC-3′，下游引物：5′-CAGACATGCACCTACCC CAGC-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TAA患者胸主动脉中ANGPTL3表达

与对照组相比，TAA患者主动脉ANGPTL3表达显著增加(P<0.05)(图1A，B)。

A.representative immunostaining of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control transplant donors(×400)； B.semiquantitative analysis of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control transplant donors; *P<0.05 compared with control group(transplant donors)图1 ANGPTL3在人胸主动脉瘤组织中增加Fig 1 ANGPTL3 was increased in human thoracic aortic aneurysm (TAA)

2.2 BAPN诱导小鼠TAA

与对照组相比，TAA模型组小鼠胸主动脉明显扩张(图2A)。TAA模型组的死亡率为60%(P<0.05)(图2B)，显著高于对照组(P<0.05)。TAA模型组小鼠主动脉中凋亡水平、IL-6、MMP-2和MMP-9的表达显著增加(P<0.05)(图2C～F)。

A.representative images of TAA features in male C57BL/6 mice；B.survival curve showing the survival of mice four weeks after BAPN administration; C.TUNEL assay and semi-quantitative analysis of aortas in control and TAA groups；scale bars: 100 μm (×200)；D.immunohistochemical staining and semi-quantification of IL-6 expression in aortic lesions of control and TAA groups (P<0.05)(×400)；E.immunohistochemical staining and semi-quantification of MMP9 expression in aortic lesions of control and TAA groups (P<0.05)(×400)；F.immunohistochemical staining and semi-quantification of MMP2 expression in aortic lesions of control and TAA groups (P<0.05)(×400)；*P< 0.05 compared with control group图2 TAA小鼠模型主动脉组织中凋亡、炎性反应和MMPs表达增加Fig 2 Apoptosis, inflammation and MMPs expression were increased in TAA

2.3 TAA小鼠中ANGPTL3的表达显著增加

TAA小鼠主动脉ANGPTL3表达显著上升(P<0.05)(图3A，B)。ANGPTL3在TAA小鼠中与平滑肌细胞存在大量共定位表达(图3C)。

A.representative immunostaining of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control mice(×400)；B.semiquantitative analysis of ANGPTL3 in the aortas of TAA and control mice, *P<0.05 compared with control group；C.co-staining of a-SMA (red) and ANGPTL3(green)(×400)图3 ANGPTL3在TAA小鼠胸主动脉中增加Fig 3 ANGPTL3 was increased in mice thoracic aortic aneurysm (TAA)

2.4 敲低ANGPTL3可显著减轻AngⅡ诱导的HASMCs凋亡

AngⅡ以时间-浓度依赖性方式促进ANGPTL3在HASMCs中的表达(P<0.05)(图4A，B)。ANGPTL3 siRNA可以显著抑制HASMCs中ANGPTL3的表达(P<0.05)(图4C)。ANGPTL3敲低后可以显著降低凋亡标志蛋白caspase-3、caspase-9的表达(P<0.05)(图5A～C)。促凋亡相关基因Bax mRNA水平显著升高(P<0.05)(图5D)，而抗凋亡相关基因Bcl-2 mRNA水平显著降低(P<0.05)(图5E)。

A.ANGPTL3 levels in HASMCs were increased after AngⅡ treatment with 25, 50, or 100 nmol/L AngⅡ for 24 hours, as assessed by Western blot；B.ANGPTL3 levels in HASMCs were increased after AngⅡ treatment with 12, 24, or 48 hours AngⅡ for 100 nmol/L, as assessed by Western blot；C.ANGPTL3 siRNA decreased the expression of ANGPTL3 in HASMCs；*P< 0.05 compared with control group图4 在AngⅡ诱导的HASMCs中ANGPTL3的表达随浓度-时间增加Fig 4 ANGPTL3 expression was increased in angiotensin Ⅱ (AngⅡ)-induced

A.caspase-3 and caspase-9 protein levels assessed by Western blot；B.caspase-3 protein levels assessed by semiquantitative analysis；C.caspase-9 protein levels assessed by semiquantitative analysis；D.real-time PCR revealed the expression of Bax；E.real-time PCR revealed the expression of Bcl-2；*P< 0.05 compared with AngⅡ group图5 敲低ANGPTL3降低了AngⅡ诱导的HASMCs的凋亡Fig 5 ANGPTL3 knockdown decreased AngⅡ-induced HASMCs

2.5 敲低ANGPTL3可显著减轻AngⅡ诱导的HASMCs中炎性因子表达

ANGPTL3敲低可以显著降低AngⅡ诱导的HASMCs中炎性因子IL-6、IL-1β蛋白的表达(P<0.05)(图6A，B)。

A.IL-6 and IL-1β protein levels assessed by Western blot；B.IL-6 and IL-1β protein levels assessed by semiquantitative analysis；*P<0.05 compared with AngⅡ group图6 敲低ANGPTL3降低了AngⅡ刺激的HASMCs的炎性因子表达Fig 6 ANGPTL3 knockdown decreased AngⅡ-induced HASMCs

3 讨论

本研究发现了ANGPTL3在人TAA组织中的表达增加，通过动物实验明确ANGPTL3在TAA组织中表达增加且与平滑肌细胞共定位。进一步细胞试验发现敲低ANGPTL3后可以减轻平滑肌细胞的凋亡以及炎性因子表达。这些结果表明，抑制ANGPTL3可能减轻TAA的发生发展。

目前胸主动脉瘤的主要病理生理学机制包括氧化应激，平滑肌细胞凋亡和炎性反应激活等。炎性细胞和凋亡的平滑肌细胞分泌的蛋白酶进一步引起血管管壁退行性变，包括细胞外基质降解和中层弹力纤维断裂，最终导致胸主动脉瘤发生。主动脉瘤体出现炎细胞浸润，通过分泌多种炎性因子及蛋白酶，进一步放大炎性反应，从而加重疾病进展。越来越多的研究表明，ANGPTL3可能参与炎性反应，并在细胞凋亡中发挥重要作用[10,13]。本研究中也发现ANGPTL3在小鼠TAA组织中与平滑肌细胞存在大量共定位，这表明ANGPTL3可能通过调控平滑肌细胞参与动脉瘤的发生发展。在平滑肌细胞中敲低ANGPTL3可以抑制炎性因子IL-1β、IL-6的表达，并且平滑肌细胞凋亡明显减轻，且促凋亡基因明显降低，抑凋亡基因明显升高。

综上所述，敲低ANGPTL3后可能通过减轻平滑肌细胞凋亡和炎性反应从而减轻TAA的发生发展。本研究为探讨TAA的分子机制及其防治提供了新的思路及靶点。