系统性红斑狼疮患者外周血调节性B细胞表达与预后的相关性

王智，丁华兵，张永生

（新疆库尔勒解放军第九五一医院，新疆维吾尔自治区库尔勒841000）

系统性红斑狼疮（SLE）是一种多因素引起的自身免疫病，可反复发作，以女性多见，发病高峰在15～40岁[1-2]。现代研究显示该病的发病涉及到行为生活方式、遗传、免疫和环境等因素的变化，也是一种多基因遗传病；临床特征是多脏器损害，多伴随有血液系统损害，可造成患者出现失血、营养缺乏或者溶血性贫血等并发症，造成严重预后[3-4]。临床上常用疾病活动指数（SLEDAI）来评价SLE的活动性，但是该种评价的客观性不强，且评价体系比较繁琐[5-6]。调节性B淋巴细胞（Breg）在免疫应答的负性调控中发挥着重要作用，可以作为抗原递呈细胞、产生抗体、分泌细胞因子，从而在肿瘤微环境中通过抑制有效的抗肿瘤免疫，促进肿瘤的发生与发展[7-8]。特别是CD19调节性B淋巴细胞可通过产生IL-10等抑制炎性细胞因子介导免疫耐受，抑制过度炎性反应，从而抑制有害的免疫反应[9-11]。本文具体探讨了SLE患者外周血调节性B细胞表达与预后的相关性，以明确调节性B细胞参与SLE免疫以及潜在的机制，以期推进SLE免疫治疗的开展。现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院得到了所有入选者的知情同意与本院伦理委员会的批准；2012年1月—2018年6月选择在本院诊治的SLE患者82例作为病例组，其中男22例，女60例；年龄6～56岁，平均（37.92±2.19）岁；平均病程（6.58±0.82）年；平均SLEDAI评分（11.48±1.49）分；平均体质量指数（21.48±1.72）kg/m2。

同期选择在本院体检的健康人群82例作为对照组，其中男24例，女58例；年龄8～58岁，平均（38.00±1.47）岁；平均体质量指数（22.09±2.77）kg/m2。2 组人群的性别、年龄、体质量指数等对比差异无统计学意义，有可比性。

纳入标准：①符合《内科学》中关于SLE的诊断标准；②采血前都未接受过化疗、放疗或免疫治疗；③SLEDAI评分≥9分。

排除标准：①非SLE引起的心、肾、脑、血液、肝、肺等系统的损害；②临床资料缺乏者。

1.2 方法

1.2.1 常规指标检测 记录2组常规血液学指标，包括红细胞计数、血小板计数、白细胞计数、血红蛋白等，由全自动血液分析仪检测。

1.2.2 外周血调节性B细胞表达情况 空腹状态下采集所有入选者的静脉血3～5 mL，平分为2管。其中一管不进行抗凝，静置放置30 min后2 000 r/min，离心15 min，取上层血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法（上海生工公司，批号20149222，检出限0～100 pg/mL）检测IL-10含量。另外一管进行乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，将外周血单个核细胞分离。每管中加入淋巴细胞分离液，体积大小与血液样本相同，采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释，3 000 r/min（离心半径12 cm）离心15 min，吸取离心后的中间层，再次PBS悬浮后离心，弃上清，细胞沉淀用5 mL PBS重悬洗涤。调整单个核细胞密度为2×106/mL；离心后加入每管加入1 mL染色buffer，震荡离心后加入 3 μL CD19 抗体、10 μL CD27 抗体进行表面抗体染色，避光孵育30 min，然后加入250 μL破膜剂，避光孵育20 min，洗涤3次。加入10 μL IL-10抗体进行细胞内染色，避光孵育40min，洗涤3次后加入400 μL stain buffer，振荡混匀后进行流式细胞仪（美国BD公司3100型）分析，以前向角和侧向角散射光散点图设门区分，记录 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞含量。

1.3 预后调查 采用病历调查、随访门诊与电话随访的方式调查病例组患者的预后死亡与存活情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.00统计学软件对本研究所涉及的计量数据与计数数据分析，采用（±s）、率等进行表示，对比方法为 t检验与 χ2检验，相关性分析采用直线相关分析，以关联系数（r）表示，检验水准为ɑ=0.05。

2 结果

2.1 常规血液学指标对比 病例组的红细胞计数、血小板计数、白细胞计数、血红蛋白都显著低于对照组（P＜0.05），见表 1。

表1 2组常规血液学指标指标对比 （±s）

表1 2组常规血液学指标指标对比 （±s）

Hb（g/L）病例组 82 3.78±0.11 3.38±0.15 45.39±5.95 74.33±2.21对照组 82 6.39±0.21 4.51±0.11 153.29±6.11 139.20±3.29 t 99.696 55.011 114.567 148.213 P 0.000 0.000 0.000 0.000组别 n WBC计数（×109/L）RBC计数（×109/L）PLT计数（×109/L）

2.2 血清 IL-10 含量和 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞比例对比 病例组的血清IL-10 含量和外周血 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 2组血清IL-10含量对比 （pg/mL，±s）

表2 2组血清IL-10含量对比 （pg/mL，±s）

组别 n IL-10 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞病例组 82 5.40±0.28 1.86±0.10对照组 82 10.64±1.57 4.36±0.25 t 29.754 8.444 P 0.000 0.003

2.3 预后情况 病例组患者随访调查至2019年12月，82例患者中死亡15例，死亡率为18.3%。其中死亡患者的 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞水平（1.52±0.14）pg/mL，显著低于存活患者的 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性 B细胞水平（1.82±0.11）pg/mL，对比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 相关性分析 在病例组中，直线相关分析患者的预后死亡与 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞比例、IL-10含量、红细胞计数、血小板计数都存在相关性（P＜0.05），见表 3。

表3 SLE患者外周血调节性B细胞表达与预后的相关性 （n=82）

3 讨论

SLE是一种病因尚不明确的累及多系统的自身免疫性疾病，滥用抗生素、病毒感染、使用染发剂等化学污染都可诱发该病[12]。该病患者几乎均有不同程度的血液学改变，贫血是血液系统损害中最常见表现，其程度轻重不一，主要包括失血性贫血、慢性病性贫血、肾性贫血等，也是造成重度贫血病例较多的原因之一[13-14]。本研究显示病例组的红细胞计数、血小板计数、白细胞计数、血红蛋白都显著低于对照组。从机制上分析，SLE可导致机体造血前体细胞和中性粒细胞受到不同自身抗体的破坏，可使得骨髓增生受到抑制，从而导致红细胞计数、血小板计数等降低[15-16]。

SLE的发生是一个多因素参与、多基因改变、多阶段发展的病变过程，免疫因素在该病的发生发展发挥重要的作用[17]。调节性B细胞与SLE的发生发展和转移密切相关，B细胞可以产生抗体参与体液免疫调节，也将识别的抗原递呈给T细胞，激活细胞免疫，使T细胞活化增殖，从而参与机体免疫应答[18-19]。调节性B细胞并无特异性的表面标志，不过IL-10被认为是其特性之一[20]。在自身免疫性脑脊髓膜炎、炎症性肠病、类风湿性关节炎等模型，调节性B细胞通过细胞—细胞接触抑制自身反应性B淋巴细胞，促进IL-10的分泌，从而可抑制有害的免疫反应[21]。本研究显示病例组的血清IL-10含量、外周血 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性 B 细胞比例显著低于对照组。表明SLE患者的CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性 B 细胞比例比较低，也伴随有IL-10的低表达。从机制上分析，IL-10是由Th2细胞活化的B细胞、单核-巨噬细胞等产生的细胞因子，通过阻断促炎因子的作用，发挥其抗炎作用[22]。SLE患者多伴随有炎性因子的过表达，从而可导致持续的免疫激活，调节性B细胞过度活化并产生大量的自身抗体及免疫复合物，也会抑制IL-10的分泌，从而形成恶性循环。并且IL-10能抑制单核巨噬细胞的抗原递呈作用，能减少黏附分子的表达，抑制IL-12合成的作用，从而阻碍Th1免疫反应[23]。

一系列复杂因素决定了个体的SLE发病易感性，包括基因缺失、细菌感染、基因变异等，但是确切的病因还不明确。该病患者的预后比较差，死亡率一直居高不下，很多患者也伴随有血管损害，包括血管内血栓形成、动脉和小动脉硬化以及坏死性动脉炎等。本研究病例组患者随访调查至2019年12月，82例患者中死亡15例，死亡率为18.3%，其中死亡患者的 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞水平显著低于存活患者；直线相关分析患者的预后死亡与 CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性B细胞比例、IL-10含量、红细胞计数、血小板计数都存在相关性。从机制上分析，调节性B细胞能通过分泌IL-10等细胞因子，下调效应T淋巴细胞对机体免疫应答的作用，从而发挥对机体的保护作用[24]。IL-10可抑制单核巨噬细胞释放炎性介质，抑制脂多糖和干扰素（IFN）-γ导致的肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6、IL-8、和粒-巨核细胞集落刺激因子分泌[25]。而调节性B细胞也可分泌IgG和IgA中和有害可溶性因子，增强清除含有潜在自身抗原的凋亡细胞[26]。不过本研究也有一定的不足，研究的样本数量较少，且调节性B细胞的具体作用机制也不明确，将在下一步进行深入分析。

综上所述，SLE患者伴随有外周血CD19（+）、Tim-1（+）、IL-10（+）和调节性 B 细胞比例与血清IL-10表达降低，与患者的预后显著相关。