动物粪便堆肥厂不同工作区空气中细菌和条件致病菌污染特征研究

杨梓晔，张卓毅，孙兴滨，高 敏，王旭明

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京 100097；3.北京市畜牧业环境监测站，北京 102200)

堆肥技术作为一种可持续的废物回收方法，被广泛应用于多种固体废物处理，包括有机固体废物、餐厨垃圾和动物粪便等。在堆肥反应过程中，原料中的细菌和真菌等微生物将有机物分解为更简单和稳定的物质，其降解产物可以作为肥料施用于农田[1-2]。然而，堆肥处理过程中与搅拌活动相关的操作(原料筛选、发酵翻堆以及成品肥包装等)会导致大量颗粒物的释放，其中就包括生物气溶胶[2-4]。作为多种微生物及其碎片的复杂混合体，堆肥厂逸散的生物气溶胶被证明可对人体健康产生不同程度的影响，包括引发过敏、急性毒性以及传染病等[2, 5]。因此，近年来人们越来越关注堆肥厂生物气溶胶的分布特征及其对厂内工人健康和周边空气环境污染造成的影响[5-7]。

目前，国内外研究人员已经针对堆肥厂空气中微生物污染展开部分研究，主要考察了堆肥厂类型[8-9]以及堆肥操作[10]对逸散微生物种类和丰度的影响。已有研究结果表明，畜禽粪便堆肥过程中，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)是堆肥粪便中常见的优势菌门。其中，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门的相对丰度要普遍高于放线菌门[10-11]。对空气中细菌菌属水平的研究结果表明，芽孢杆菌属(Bacillus)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、温双岐菌属(Thermobifida)和糖单孢菌属(Saccharomonospora)在空气中相对丰度较高[1]。堆肥生产的运行参数(如堆肥天数[12]和堆肥温度[13])对空气中细菌的群落结构均有影响。然而，目前对不同工作区域生物多样性和群落结构缺乏系统的比较分析。作为堆肥的主要原料，畜禽粪便中常含有大量的人类条件致病菌，这些病菌可以逸散至空气中，主要包括密螺旋体属(Treponema)、纤毛菌属(Leptotrichia)、梭菌属(Fusobacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、弓形杆菌属(Arcobacter)、弯曲菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)和沙门氏菌属(Salmonella)等[14]。已有研究结果显示，经过持续高温堆肥过程，包括沙门氏菌属和布鲁氏菌属(Brucella)在内的80%人类条件致病菌可以被去除[13]。但堆肥过程中的原料预混和堆肥搅拌等操作，可能会使原料中的人类条件致病菌逸散到空气中，对人体健康构成风险。目前关于堆肥厂空气中人类条件致病菌的研究较少，对不同工作单元空气中致病菌的区域性差异鲜见相关报道。

针对以上情况，笔者对北京市怀柔区的一家商业堆肥工厂空气中总颗粒物样本进行多次采集，检测了堆肥区、包装区和办公区3个区域空气中的细菌生物多样性和群落结构，重点分析了不同区域空气中人类条件致病菌的差异性和相关性，以期探究堆肥厂空气中细菌和人类条件致病菌的区域性差异特征。

1 材料与方法

1.1 样本收集

于2016年9月对北京市怀柔区的一家商业堆肥厂(116.56° N,40.68° E)进行空气样本采集。该堆肥厂的原料主要来自于养殖场(牛、家禽和猪)的动物粪便，并添加蘑菇渣和玉米秸秆等混合物作为辅料,其单批次堆肥操作周期约为1个月。该研究对堆肥厂进行了4次空气样本采集(分别在9月12、18、20和21日)，共采集总颗粒物(TSP)样本12个，其中堆肥区(C)、包装区(P)和办公区(L)样本数均为4个。

TSP样本采集使用中流量空气颗粒物采样器(青岛崂应，2030)，采样高度为1.5 m，样本被收集在2.2 μm 孔径的石英滤膜(瑞典Munktell，NO.420065) 上。样本采集时间为24 h，气体流量为100 L·min-1。每次采样完成后，将载有颗粒物的滤膜放入膜盒中，利用冰盒运回实验室，并置于-80 ℃条件下保存。每次样本采集前后用φ=75%的乙醇溶液对采样器进行清洁，采样之前对相关仪器进行校准。

1.2 DNA的提取和16srRNA基因测序

研究采用MP FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒(MP Biomedicals) 对石英滤膜附着的颗粒物进行总DNA 抽提，利用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific，美国)测定DNA 浓度和纯度。使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行 PCR 扩增。

PCR反应体系包括5×FastPfu Buffer(4 μL)、dNTPs(2.5 mmol·L-1，2 μL)、Forward Primer(5 μmol·L-1，0.8 μL)、Reverse Primer(5 μmol·L-1，0.8 μL)、BSA(0.2 μL) 和Template DNA(10 ng)，最后用ddH2O补充至20 μL。使用如下反应条件进行PCR扩增：预变性温度为95 ℃，时间3 min；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环40次；72 ℃保持10 min；最后10 ℃保温。扩增产物利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序分析(上海美吉生物医药科技有限公司)。

使用Trimmomatic软件原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接：(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的序列(reads)，去除含N碱基的reads；(2)根据PE reads之间的重叠(overlap)关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小重叠长度为10 bp；(3)拼接序列的重叠区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；(4)根据序列首尾两端的条码(barcode)和引物区分样品，并调整序列方向，条码允许的错配数为0，最大引物错配数为2。使用UPARSE软件(Version 7.1)根据97%的相似度对序列进行 OTU 聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对 Silva 数据库(SSU128)，设置比对阈值为70%。该研究中涉及到的人类条件致病菌定义参照文献[14]。

1.3 数据分析与统计

研究使用Origin 8.5软件生成箱型图和柱状图，R3.6.3软件中的pheatmap分析包生成热图，用于表示前50个优势菌属、37个菌门以及11个人类条件致病菌属的相对丰度。利用Statistics 2.0软件分别对不同工作区空气细菌生物多样性和相对丰度的相关性(Spearman 相关性分析)和差异性(one-way ANOVA)进行分析。利用R3.6.3软件中的ape和ggplot2程序包绘制CPCoA约束主坐标分析图，分析不同工作区域空气细菌群落之间的差异性。设定P<0.05表示在95%的置信水平内有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 动物粪便堆肥厂不同工作区空气中的细菌分布特征

首先对堆肥厂不同工作区域空气中细菌的丰富度(OTU数量)和多样性(Shannon指数)进行分析，并比较以上参数在不同区域之间的差异。由表1可知，堆肥区、包装区和办公区这3个采样区的OTU数值范围分别为1 060～1 280、1 070～1 490和1 110～1 580。办公区空气细菌丰富度的平均值(1 340±175)高于包装区(1 290±149)和堆肥区(1 220±95)，但差异未达显著水平(P=0.335，P=0.643)。

表1 堆肥厂不同工作区域空气细菌生物多样性和丰富度分析Table 1 Biodiversity and abundance of bacterial aerosol in different areas of composting plant

利用Shannon指数对比分析堆肥厂3个工作区域空气细菌多样性之间的差异。结果显示，堆肥区、包装区和办公区空气细菌的Shannon指数范围分别为4.67～5.23、4.62～5.70和5.01～5.57。与丰富度研究结果相似，细菌多样性的最高值出现在办公区(5.25±0.21)，其余依次为包装区(5.03±0.44)和堆肥区(5.00±0.21)。同样，该差异未达显著水平(P=0.070，P=0.190)。

为探讨堆肥厂空气中微生物丰富度和多样性之间的关系，对OTU数量与Shannon 指数之间的相关性进行分析。整体上，堆肥厂空气中细菌的OTU数量与Shannon指数呈显著正相关(r=0.965，P=0.002)，即微生物丰富度和多样性之间变化趋势一致。对不同区域的相关性分别进行分析，发现每个区域OTU数量与Shannon指数之间的相关性存在差异。

对堆肥厂不同工作区空气中细菌群落的特征进行对比，对优势菌门和优势菌属进行分析，结果如图1所示。由图1可知，3个采样区域空气中优势细菌门分布规律整体相似，前3个优势门均为厚壁菌门(相对丰度为35.95%±10.29%)、变形菌门(30.76%±11.50%)和放线菌门(21.11%±6.76%)，这与以往报道结果相似。厚壁菌门、变形菌门和放线菌门是堆肥厂[15]、养猪场[14]和养鸡场[16]空气中主要的细菌门类。造成这一现象的主要原因是富含孢子的微生物(厚壁菌门和放线菌门)更容易被气溶胶化而逸散至空气中[17]。对3个工作区空气中优势菌门的相对丰度进行对比分析，3种优势菌门的区域性差异显著。例如，厚壁菌门是堆肥区(39.43%±3.55%)和包装区(42.06%±9.04%)空气中相对丰度最高的菌门，而办公区空气中变形菌门(41.90%±11.95%)的丰度最高。其中，厚壁菌门(42.06%±9.03%)和放线菌门(26.74%±5.04%)在包装区的相对丰度显著高于办公区(26.37%±9.05%)，(14.66%±4.57%)(P=0.033,P=0.01)，而变形菌门在办公区(41.90%±11.95%)的相对丰度显著高于包装区(20.41%±2.98%)(P=0.006)。变形菌门是革兰氏阴性菌的主要门，也是人体皮肤微生物群和许多病原体的重要组成部分[18]。导致变形菌门在办公区相对丰度较高的原因可能是办公区室内空气中的细菌群落同时受到堆肥区、包装区及人为活动的综合影响[19]。堆肥原料作为生物气溶胶的重要来源，堆体中微生物的变化可以对空气微生物的差异给予解释。例如，成品肥料包装区空气中变形菌门的相对丰度(20.41%±2.98%)较堆肥区(29.97%±3.61%)降低约10%(P=0.149)，这与已有报道中堆肥前后堆体变形菌门相对丰度的下降幅度一致[13]。总体而言，堆肥厂生产区域(堆肥区和包装区)空气中细菌的优势菌门与办公区种类相似，但具体优势菌门的相对丰度存在区域性差异。

与菌门分布规律类似，3个区域空气中优势菌属种类相近，但相对丰度有所不同。共有优势菌属均为不动杆菌属(Acinetobacter)(13.02%±6.23%)和棒状杆菌属(Corynebacterium)(7.56%±4.57%)。其他相对丰度较高的菌属还包括堆肥区的肠杆菌属(Enterobacter)(7.40%±4.04%)，包装区的动性球菌属(Planococcus)(12.00%± 8.35%)，以及办公区的气单胞菌属(Aeromonas)(4.01%±5.63%)。其中不动杆菌属在堆肥区(12.06%±4.52%)和办公区(16.33%±6.10%)空气中相对丰度最高，但两者与包装区(9.68%±5.32%)无显著差异(P=0.600,P=0.114)。而棒状杆菌属在包装区(12.36%±4.28%)的相对丰度最高，且与堆肥区(6.37%±2.21%)和办公区(3.96%±1.44%)相对丰度的差异具有统计学意义(P=0.032,P=0.006)。已有报道显示，堆肥后棒状杆菌属和节细菌属(Arthrobacter)的相对丰度呈下降趋势，不动杆菌属可以被完全去除[13]，但笔者研究对空气中细菌菌属的分析并未发现类似趋势。值得注意的是，不动杆菌属和棒状杆菌属这2个菌属通常携带多种抗生素抗性基因[20]，对其相对丰度的变化规律研究可为多角度评价堆肥厂空气中微生物的潜在风险提供相应数据。

利用约束主坐标分析法(CPCoA)分析了堆肥厂不同区域空气中细菌群落结构之间的关系，细菌菌门和菌属之间的聚类分析结果如图2所示。结果显示，所调查3个区空气中细菌菌门和菌属的整体差异具有统计学意义(P<0.05)，菌属水平上的群落结构差异性更为显著。在细菌门水平上，办公区和堆肥区空气中细菌群落结构的进化关系较办公区和包装区更为接近。虽然菌属水平的聚类分析也得到了类似结果，但是该水平上各个采样区域空气微生物的群落结构差异更为明显(P=0.001)。结合图2分析可知，优势菌的区域性差异导致了其群落结构相似性的整体差异。

为分析堆肥厂工作区(堆肥区和包装区)逸散微生物对办公区空气造成的可能影响，对3个区域细菌菌门和菌属的差异和共有部分进行详细分析(图3)。结果显示，办公区空气中特有细菌菌门数量最高(6个)，其次为包装区(2个)，堆肥区空气中规与其他2个区不同的特有菌门。3个区域共有菌门分析结果显示，堆肥区与包装区的共有菌门数量(26个)高于堆肥区与办公区共有菌门数量(24个)，说明堆肥区与包装区细菌菌门更为相似。

与细菌菌门结果相似，办公区检测到的特有菌属数量最高(71)，在堆肥区也检测到了15个特有细菌菌属，高于包装区(13个)。与菌门分析结果一致，包装区和办公区共有菌属数量最高，为457个，其余依次为堆肥区和办公区(447)、包装区和堆肥区(431)。对不同区域空气中特有菌属和菌门的分析结果显示，2种水平上办公区空气中特有微生物的比例均为最高，分别为18.75%和12.54%。而3个区共有的菌属和菌门在堆肥区占比均为最高，分别为85.19%和85.14%。在菌属水平上，包装区空气中微生物对办公区的影响要大于堆肥区。

2.2 动物粪便堆肥厂不同工作区空气中人类条件致病菌分布特征

近年来，人们对可引起呼吸道过敏和感染的相关菌属关注度持续增加[21-23]。该研究对动物养殖场空气中常见的11种人类条件致病菌进行分析，以考察动物粪便堆肥厂空气中人类条件致病菌的区域性分布特征。使用CPCoA方法对3个区域空气中人类条件致病菌的整体结构差异进行分析，结果见图4。堆肥区、包装区和办公区空气中人类条件致病菌的结构整体上有所不同，但差异并不显著(P=0.34)。进一步利用Heatmap图对11种目标人类条件致病菌的相对丰度进行分析，结果显示不动杆菌属为11种人类条件致病菌中的优势菌属，其相对丰度在4.02%～26.82%之间，其余10种人类条件致病菌的相对丰度均低于1%，该结果与之前对养殖场空气中人类条件致病菌的研究结果相似[14]。

为探究堆肥厂工作区域(堆肥区和包装区)空气中人类条件致病菌对办公区空气造成的可能影响，分析工作区域(堆肥区和包装区)和办公区空气中11个人类条件致病属之间的相关性，结果见表2。办公区和堆肥区显著相关的人类条件致病菌有2个，分别为弓形杆菌属(r=0.993，P=0.007)和链球菌属(Streptococcus)(r=0.984，P=0.016)；办公区和包装区显著相关的2种人类条件致病菌分别为螺杆菌属(r=1.000，P=0.000)和肠球菌属(Enterococcus)(r=-0.969，P=0.031)。除此之外，对堆肥区和包装区空气中的人类条件致病菌的相关性进行分析，结果并未发现显著相关性。综合分析以上结果，不同工作区域(堆肥区和包装区)人类条件致病菌对办公区造成的影响不同，具体菌属存在差异。

表2 堆肥区、包装区和办公区空气中11种人类条件致病菌相对丰度的相关系数Table 2 Correlation coefficient of human pathogenic bacteria in the air of compost, packing and office areas

整体上，11种人类条件致病菌中不动杆菌属的相对丰度最高(13.03%±6.23%)，显著高于其他10种人类条件致病菌，螺杆菌属的相对丰度最低(0.002%±0.004%)。其中，不动杆菌属相关的多个种属是引起医院内感染的重要人类条件致病菌，特别是当机体免疫力低下时，可引起呼吸道感染、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染等，重症者可导致死亡[24-25]。

除此之外，笔者在养殖厂空气中也检测到相对丰度较高的葡萄球菌属(Staphylococcus)(0.490%～0.093%)和肠球菌属(1.30%～0.042%)，与其相关的多个种属是最重要的革兰氏阳性医院感染病原菌。例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)被认为是医院感染最重要的诱因之一，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌更是引起了全世界44%的医院感染[26]。另一种丰度较高的分支杆菌属(Mycobacterium)(0.320%～0.073%)中2个重要的种属为结核分枝杆菌(M.tuberculosis)和麻风分枝杆菌(M.leprae)，主要通过呼吸道或皮肤粘膜损伤进入机体，引发相关疾病[27]。

对不同区域空气中以上11种人类条件致病菌的差异进行分析，结果如图5所示。

同一种人类条件致病菌属在不同区域之间的相对丰度存在差异。整体上11种人类条件致病菌在办公区的相对丰度高于堆肥区和包装区，其中梭菌属、埃希氏杆菌属(Escherichia)和密螺旋体属这3种人类条件致病菌属的相对丰度显著高于堆肥区和包装区(P<0.05)。由于人类条件致病菌大多不能在高温下存活，因此堆肥过程被认为可以完全或者极大程度降低人类条件致病菌的相对丰度[13]，但该研究并没有在堆肥区和包装区空气中检测到人类条件致病菌相对丰度的显著差异。说明包装区空气中人类条件致病菌除了受到固体成品肥逸散微生物的影响之外，可能还受到其他因素的影响，比如由堆肥区空气传输过来的微生物。办公区中相对丰度最高的3个菌属依次为不动杆菌属(17.33%±6.10%)，肠球菌属(0.51%±0.24%)和埃希氏杆菌属(0.41%±0.12%)，埃希氏杆菌属可引起腹泻和泌尿系统感染等疾病[28]。以上研究结果是基于11个人类条件致病菌属的相对丰度数值，后续还需对空气中微生物总浓度或者每种目标微生物的绝对浓度进行定量分析。

3 结论

研究堆肥厂不同工作区空气中细菌及人类条件致病菌的丰度和类型，对于综合评估其潜在健康风险和环境污染至关重要。该研究发现堆肥区、包装区和办公区3个区域空气中细菌群落差异显著，办公区细菌的丰富度和多样性均高于堆肥区和包装区。虽然在3个区域空气中11种人类条件致病菌的群落结构没有显著差异，但人类条件致病菌的相对丰度存在区域性差异。堆肥区和包装区空气中各有2种人类条件致病菌与办公区存在显著相关性。初步结果显示，堆肥厂堆肥区和包装区空气中细菌和人类条件致病菌可逸散至办公区，对其空气产生污染。