扁桃体鳞状细胞癌中CK7 CK19和p16的表达关系研究

颜启璋，陈海波，路 莹，曹 勇，温文胜，于大海

研究发现人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)与口咽癌尤其扁桃体鳞状细胞癌(tonsil squamous cell carcinoma,TSCC)密切相关，且该种HPV相关性口咽癌有特殊的临床生物学特点，如早期淋巴结转移但预后较好[1，2]。国外研究[2，3]显示，这种口咽癌发生与性生活习惯有关，但随着国内外生活习惯的趋近，近来该疾病在国内的发病率也呈上升趋势。细胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)是单层和柱状上皮的标志物，通常不表达于正常的鳞状上皮细胞，而特异性地表达在子宫颈和口咽(扁桃体)组织上皮的交界处[4]。细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)在复层鳞状上皮的基底细胞层中正常表达，目前被认为是癌前病变和口腔鳞癌等癌症的易感性标志物[5，6]。CK7和CK19上调与HPV感染所致的宫颈癌和口咽癌密切相关[4，5]。p16INK4a蛋白(p16)是直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的抑癌蛋白，p16蛋白在正常细胞中表达水平较低，但在许多HPV相关的宫颈癌以及口咽癌中均高表达，为公认的HPV感染替代标志物[7～9]。研究[10]表明，在HPV相关性口咽癌中，HPV的致癌活性主要与E7蛋白在肿瘤细胞中的表达有关，而E7可结合视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)抑癌蛋白并促进其降解，导致细胞周期失控，p16蛋白大量表达。虽然目前对于CK7、CK19和p16在口咽癌致癌机制中的作用以及它们相互的时空影响及其表达规律尚不清楚，但有研究[11，12]认为，在这个过程中CK7和CK19的参与起了重要的作用。关于三者在口咽癌中表达关系的研究仍较少，尤其是他们在相同部位表达关系的比较，以及癌组织、癌周隐窝上皮和表面上皮表达的比较更是鲜见报道。由于口咽包括扁桃体及软腭等部位，为了减少混杂因素，本研究仅选取腭扁桃体鳞状细胞癌病例，通过连续石蜡切片，选取3～5个视野观察比较CK7、CK19和p16在同一部位的表达关系，探讨其与HPV相关性扁桃体癌变机制的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2015-07～2018-01广西医科大学第一附属医院耳鼻喉头颈外科收治的17例TSCC患者的病历资料及组织样本，其中男12例，女5例；年龄39～77岁；汉族13例，壮族4例；病程1～48月。病理诊断分别为高分化鳞癌7例，中高分化鳞癌3例，中分化鳞癌5例，中低分化鳞癌1例，低分化鳞癌1例。纳入标准：(1)病理标本确诊为腭扁桃体鳞状细胞癌；(2)病案资料详细完整；(3)具有完整的石蜡标本进行连续切片的检测。排除标准：(1)临床诊断与术后病理不一致者；(2)合并多种慢性疾病者；(3)既往有TSCC及其他恶性肿瘤病史。石蜡标本来自广西医科大学第一附属医院病理科，每个病例的石蜡标本取5 μm连续石蜡切片7～8张，可以在同一视野中比较CK7、CK19和p16的表达关系，能更好地反映表达的时空变化。

1.2主要试剂 一抗：p16(MAB-0673鼠单抗)、CK7(Kit-0021鼠单抗)和CK19(Kit-0030鼠单抗)的即用型抗体试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。二抗：即用型快速免疫组化MaxVision HRP鼠/兔试剂盒(Kit-5010)购自福州迈新生物技术开发有限公司。抗原修复液：Tris-EDTA抗原修复液(10×，pH=9.0；FD8804)购自杭州弗德生物科技有限公司。DAB显色液：DAB显色试剂盒(20×；ZLI-9018)购自北京中衫金桥生物技术公司。

1.3HE染色及免疫组化染色 所有标本取4张连续石蜡切片进行常规HE染色以及p16、CK7和CK19免疫组化染色。连续石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水后，采用Tris-EDTA行抗原修复，滴加3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，经PBS缓冲液洗涤，先后滴加一抗及二抗孵育，DAB显色后苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判断 p16、CK7和CK19的阳性染色是指组织切片中目标细胞的胞核/胞质见黄色或棕黄色着色，且无背景染色。通过染色细胞百分率测定CK7和CK19的免疫反应性。阳性细胞百分率分级[13]：阴性细胞(<1%)，以“-”示；斑片染色(1%～40%)，以“+”示；弥漫染色(>40%)，以“++”示。根据中国及美国的诊断规范[14，15]将p16免疫组织化学检测示≥70%的肿瘤细胞核和细胞质中等至强阳性但未行HPV DNA/RNA检测的鳞状细胞癌定义为HPV相关性(p16+)鳞状细胞癌，故本研究将p16染色细胞百分率分级定为：阴性细胞(<1%)，以“-”示；斑片染色(1%～70%)，以“+”示；弥漫染色(>70%)，以“++”示。本研究以p16呈弥漫染色(>70%)作为判定HPV相关性(p16+)TSCC的标准。

1.5统计学方法 应用SPSS25.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数(n)表示，采用Kappa一致性检验分析p16、CK7和CK19检测结果的一致性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.117例TSCC癌组织及癌周正常上皮CK7、CK19和p16的免疫组化染色检测结果 CK7、CK19、p16阳性染色均见于鳞癌细胞胞质。在11例CK7+中，仅1例呈弥漫染色(++)，10例呈斑片染色(+)。在15例CK19+中，有9例呈弥漫染色(++)，6例呈斑片染色(+)。在8例p16+中，有5例呈弥漫染色(++)，3例呈斑片染色(+)。除了CK7、CK19和p16三者同时阳性的病例外，检测还发现了CK7-CK19+p16+的病例2例；未见单独CK7+的病例，或者是CK7+和p16+而CK19-的病例，但有CK7+伴CK19+而p16-的病例。在p16强阳性(++)的病例中，皆伴随CK19强阳性(++)。本研究的17例TSCC患者共有5例为HPV相关性(p16+)鳞状细胞癌，另12例为非HPV相关性鳞状细胞癌。见表1，图1，2。

2.2HPV相关性(p16+)TSCC组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果 由于HPV相关性(p16+)TSCC样本量较小(5例)，故分析选取了20个视野(每个样本选4个视野)进行分析。Kappa一致性分析结果显示，CK7与CK19、CK7与p16以及CK19与p16的检测结果均具有一致性(P<0.05)。见表2。

表1 17例TSCC癌组织及癌周正常上皮CK7、CK19和p16的免疫组化染色检测结果

ⓐHE染色；ⓑ免疫组化染色见CK7在癌组织中尤其是癌巢内表面呈弥漫染色(++，黑箭头示)，在隐窝上皮呈阴性(白箭头示)；ⓒ免疫组化染色见CK19在癌组织(黑箭头示)和隐窝上皮(白箭头所示)均呈弥漫染色(++)；ⓓ免疫组化染色见p16在癌组织(黑箭头所示)和隐窝上皮(白箭头所示)均呈弥漫染色(++)

ⓐHE染色；ⓑ免疫组化染色见CK7主要表达于上皮表层，呈斑片染色(+，黑箭头示)；ⓒ免疫组化染色见CK19主要表达于上皮下层和基底细胞，呈斑片染色(+，黑箭头示)；ⓓ免疫组化染色见p16主要表达于上皮下1/3至全层，呈斑片染色(+),与CK19部位基本重叠(黑箭头示)

表2 HPV相关性(p16+)TSCC组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果(n)

2.3非HPV相关性TSCC组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果 对于非HPV相关性TSCC组织，Kappa一致性分析结果显示，CK7与CK19、CK7与p16以及CK19与p16的检测结果不具一致性(P>0.05)。见表3。

表3 非HPV相关性TSCC组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果(n)

2.417例TSCC癌周表面上皮组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果 对于TSCC癌周表面上皮组织，Kappa一致性分析结果显示，CK7与CK19、CK7与p16以及CK19与p16的检测结果均具有一致性(P<0.05)，其中以CK19与p16的检测结果一致性最强。见表4。

表4 17例TSCC癌周表面上皮组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果(n)

2.517例TSCC癌周隐窝上皮组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果 对于TSCC癌周隐窝上皮组织，CK7与CK19、CK7与p16以及CK19与p16的检测结果均具有一致性(P<0.05)，且一致性均较强。见表5。

表5 17例TSCC癌周隐窝上皮组织CK7、CK19、p16检测结果的Kappa一致性分析结果(n)

3 讨论

3.1E7是HPV相关口咽癌的主导性癌蛋白，CK7氨基酸91-96序列中的SEQIKA片段可与E7 mRNA结合，防止其降解，在角蛋白家族中只有CK7和E7有这种特异性的反应。而CK7特异性地表达于连接部位，如宫颈连接处上皮及扁桃体隐窝上皮。HPV感染机体后CK7可与E7 mRNA结合并锁定其转录，而CK19作为CK7的异源二聚体，通过与CK7 SEQIKA片段结合，解除锁定并促进E7 mRNA翻译成癌蛋白[4，11，12，16]。E7与Rb抑癌蛋白结合并使之被降解，而Rb抑癌蛋白的失活解除了对p16转录的抑制，造成p16过度表达[10]。在HPV感染过程中，CK7和CK19调控E7、p16的表达机制仍未明确，认为CK7和CK19在参与调控E7的过程，可能存在一种“CK7→CK19→p16轴”的关系，但其是否存在严格的时间顺序在临床病理研究中尚未得到阐释。

3.2本研究通过连续切片研究发现，无论在癌组织还是在癌周正常上皮中，除了CK7+CK19+p16+以外，还存在CK7+CK19+p16-或CK7-CK19+p16+的情况，但未出现CK7+CK19-p16+的情况。且统计学结果显示，在癌周正常上皮和癌组织中，CK7、CK19和p16具有关联性，提示可能存在“CK7→CK19→p16轴”的调控机制。本研究结果中的CK7+CK19+p16-可能是由于CK7与CK19的配对属性造成的[13]，故二者能同时表达，而p16-说明该例TSCC可能并不是由HPV感染引起的癌变。另一方面，Huang等[17]发现，在宫颈上皮低度恶性病变中，CK7的表达是向恶性转化的标志，而p16的表达与之无关。另外，Hashiguchi等[18]发现，在宫颈癌中，随着病情的进展，CK7的表达消失可预示宫颈癌的进展及预后不良。Woods等[4]发现在扁桃体隐窝上皮CK7特异性强阳性表达，而扁桃体癌中也发现CK7-和p16+的现象，认为是因为CK7随着肿瘤进展和细胞分化而失去表达。Lee等[13]在宫颈癌变过程中的研究也发现，随着癌变进展，CK7在癌前病变阶段高表达，且随着癌变进展，在癌时却有近1/3的病例呈CK7-CK19+p16+的情况。说明CK7的表达可能是HPV感染的一个“早期事件”和先决条件，随着病情的进展，CK7表达会逐渐消退，而p16的表达与CK19密切相关，是在HPV感染致癌过程中出现的“后期事件”。其中CK19可能起到了承上启下的重要作用。

3.3本研究发现，在TSCC癌周正常表面上皮及隐窝上皮均有CK7、CK19及p16的表达。CK7主要表达于上皮表层，CK19主要表达于上皮下层及基底部，而p16主要在上皮的下1/3至全层表达，与CK19部位基本重叠。统计学结果也显示，在癌周正常上皮中，CK7、CK19和p16具有关联性，且CK19和p16的表达具有显著一致性。Lee等[13]的研究结果也发现，在宫颈上皮内瘤变时，可观察到上皮表层CK7和基底CK19的同时表达，随着恶变的进展，CK7逐渐向下层扩展；而CK19的表达逐渐向上，且伴p16的表达，部位与之重叠，认为这是由于受到不同或复合的高危HPV感染，上皮表层来自鳞状-柱状上皮交界处的CK7+细胞和下层CK19+基底干细胞同时发生肿瘤转化。而Woods等[4]发现，CK7表达于正常扁桃体以及TSCC癌周的隐窝上皮表层，但在表面上皮中未见表达，认为HPV感染引起的癌变应该来源于隐窝上皮而且是上皮表层，而不是深层。因此推测CK7需要CK19的参与才会进一步导致p16的表达。虽然本研究还发现了CK7、CK19和p16同时强阳性表达的病例，但这种强阳性表达可能正处于癌症内表达达到峰值的时间点，随后CK7逐渐消退。因此我们仍然认为CK7的表达需要CK19的参与才会引起癌变，如果没有CK19对E7 mRNA翻译的促进作用，CK7将无法引起p16的表达。

3.4另外，Klingenberg等[19]在262例非肿瘤扁桃体组织的研究发现，扁桃体隐窝以及表面上皮全部为p16-。而本研究针对扁桃体癌不仅在隐窝上皮中观察到了类似的情况，也观察到癌周的扁桃体表面上皮也有相似的表达，这说明在扁桃体受HPV感染引起癌变的情况下，可能表面上皮逆向地受到了癌组织HPV感染，这也符合高危型HPV可以感染暴露的基底细胞向鳞状上皮分化后向上分裂和迁移的观点[13]，或者癌组织的CK19和p16的表达可以反向诱导上皮表达CK19和p16。此外，由于CK7可表达于多种有分泌能力的细胞，因此，在上皮表层以及癌巢内表面的CK7阳性细胞还具有分泌释放病毒的能力，有助于感染播散，而其表达降低则抑制了这种能力，这也许是机体组织的一种防御机制[13]。

3.5本研究还存在一些不足之处，虽然本课题组对所有样本均进行了HPV-DNA的原位杂交检测，而实验结果均为HPV-DNA阴性，这可能与HPV-DNA原位杂交的敏感度较低有关，这与临床上采用相同的方法所得的结果相类似[20]，当然也可能与实验操作中的疏忽或样本量较少有一定关系。由于p16的过表达在HPV驱动肿瘤细胞的存活中发挥重要作用，从而突出了p16免疫组化染色作为HPV阳性的替代指标的适用性[20]。因此本研究参照国内外的诊断规范采用p16作为HPV感染的替代标志物[14，15]。

综上所述，CK7、CK19和p16在HPV相关性(p16+)TSCC中的表达可能存在“CK7→CK19→p16轴”的调控机制。但是，在这个过程中，CK7和CK19所起的作用仍未明确，例如CK7表达消退是癌变进展的必需，还是仅为癌变的后果；CK7在隐窝上皮的特异表达，是不是HPV感染导致癌变所必需，在其他CK7不表达的部位是否就不会发生癌变；或者是否还有其他因子也可引起CK19发生类似的调控机制，这还需开展体内外试验研究进一步证实。