棘孢木霉菌剂对黄瓜生理特性及产质量的影响

2021-05-11马光恕张君鸣

中国农业大学学报 2021年6期

廉华马光恕* 李梅张帆张君鸣

(1.黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，黑龙江大庆 163319；2.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100081)

黄瓜(CucumissativusL.)是我国最主要的瓜菜之一，2017年我国黄瓜种植面积已达1 237 000 hm2，产量达到6.5×1010kg，占到世界黄瓜总产量的77%[1]。随着黄瓜种植面积逐年扩大，促进黄瓜生产对其长期发展具有重要意义，特别是设施黄瓜生产中，由于持续连作和病害加剧造成黄瓜产量持续下降，逐渐成为影响我国黄瓜生产的最大障碍[2]。各种农业管理措施如土壤处理、合理轮作、土壤杀菌和人工引入有益微生物等成为保证黄瓜产量和品质的主要手段[3]，木霉(Trichodermaspp.)就是其中主要应用措施之一。

木霉菌属真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲丛、梗孢目、丛梗孢科，是目前研究和应用最为广泛的生防真菌类型之一[4]。Masunaga等[5-6]研究表明，木霉菌是一类重要的植物根际促生真菌(Plant growth-promoting rhizosphere fungus，PGPF)，通过分泌植物生长激素等物质，具有促进植物生长的功能。关于木霉促进植物生长、改善植物生理代谢、提高产量和改善品质的研究报道较多，如Metwally等[7]研究表明，绿色木霉(T.aviride)和丛枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi)不仅能提高洋葱的鲜重和干重，还能促进其形态指标如叶面积、茎长和根长等增加，而且能提高洋葱色素含量；Zhang等[8]研究发现，哈茨木霉(T.harzianum)可提高黄瓜叶片的可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素含量和根系活力，促进盐胁迫下黄瓜生长；而Estifanos等[9]研究发现，木霉不仅能够提高黄瓜株高，而且可以提高黄瓜产量；Carlos和José[10]利用多孢木霉(T.polysporum)LCB50单独施用于甜瓜，甜瓜枯萎病防效达到32.2%，产量增加27%。

木霉菌在其生命过程中可以产生菌丝体、分生孢子和厚垣孢子3种繁殖体，目前国内外已经有50多种木霉商品化制剂[11]，如美国的哈茨木霉T22菌株和以色列的哈茨木霉T39菌株，新西兰的木霉制剂Trichodry和Trichoflow、俄罗斯的木霉制剂Myc01、韩国的木酶制剂YC458、西班牙的哈茨木霉和绿色木霉混合生防制剂TUSAL等[12]，上述商品化制剂均为木霉菌分生孢子制剂或分生孢子与菌丝体混合制剂。由于木霉菌厚垣孢子制剂不易生产，人工发酵条件要求比较严格，限制了厚垣孢子制剂的生产和应用[11]。与厚垣孢子制剂相比，分生孢子制剂虽然存在货架期较短和防治效果易受环境条件影响的弊端，但木霉菌分生孢子的产生条件相对宽松，条件适宜时在各种固体或液体培养基均能产生，生产上使用的木霉菌剂多为分生孢子制剂。因此继续开发性能稳定的木霉菌分生孢子制剂，对于保证植物高产和优质生产具有重要意义。本研究选择的棘孢木霉(T.asperellum)525，在前期对黄瓜枯萎病菌平板对峙试验中抑制率达到80.24%且田间防治效果达到81.53%，所以以其为试验菌种，制备棘孢木霉525分生孢子菌剂，系统研究其对黄瓜幼苗生长、生理特性、产量和品质的影响，旨在为促进黄瓜优质和安全生产给予技术支撑，为木霉菌剂未来研发和推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试黄瓜品种

‘长春密刺’，购买于山东新泰市裕园种业有限公司。

1.1.2供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)[13]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)[13]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

木霉选择性培养基(PDAm)[14]：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，氯霉素0.3 g，玫瑰红(孟加拉红)0.02 g，水1 000 mL。

1.1.3供试菌株

棘孢木霉Trichodermaasperellum525，由中国农业科学院植物保护研究所木霉菌研究组提供。

1.1.4供试基质材料

试验中所使用的基质材料是草炭和蛭石的混合物，草炭∶蛭石(体积比)=2∶1(基质基本农化性状如下：pH 6.92，有机质34.5%，碱解氮760 mg/kg，速效磷53 mg/kg，速效钾157 mg/kg)。基质过筛(1 mm)后于烘箱中160 ℃高温灭菌2 h，自然冷却后继续在160 ℃烘2 h后放凉备用。

1.2 棘孢木霉分生孢子粉剂的制备

将棘孢木霉菌 525挑在PDA平板上，置于28 ℃ 活化培养3 d，后从菌落边缘取直径5 mm的菌饼，转接到PDA培养基上，28 ℃培养7 d，再用无菌水洗下孢子，制成木霉孢子悬液。用无菌水梯度稀释后，涂布于木霉选择培养基上[14]，在25～28 ℃ 下倒置培养1～2 d，计菌落数，计算木霉分生孢子含量。大麦粒在室温下用清水浸泡1夜，捞出沥水，装入保鲜袋，每袋1 kg，灭菌；冷却后接入棘孢木霉孢子悬液，置于25 ℃培养箱培养2～3周；待长满孢子后，加无菌水冲洗，滤除麦粒。滤液中加入10%的滑石粉，混合后粉碎、抽滤和干燥，制成棘孢木霉分生孢子粉剂。棘孢木霉分生孢子菌剂浓度为2.8×107cfu/g，按照试验要求计算应用剂量。

1.3 试验方法

1.3.1苗期试验

2019年4—8月，在黑龙江八一农垦大学教学基地塑料大棚内开展相关试验研究。将灭菌土装入塑料材质的育苗盘(34.5 cm×24 cm×11 cm)中，将不同浓度棘孢木霉分生孢子菌剂拌入装有灭菌土的育苗盒中。播种催芽处理后的黄瓜种子，每盘播80粒，出苗后选留50株。播种后每隔2 d浇施一次无菌水，每盘浇施1 000 mL，保持黄瓜正常生长状态。

试验共设置6个处理：(1)接种浓度为103cfu/g棘孢木霉菌剂(T1)；(2)接种浓度为104cfu/g棘孢木霉菌剂(T2)；(3) 接种浓度为105cfu/g棘孢木霉菌剂(T3)；(4)接种浓度为106cfu/g棘孢木霉菌剂(T4)；(5)接种浓度为107cfu/g棘孢木霉菌剂(T5)；(6)接种无菌水(CK)。随机区组设计，每个处理接种4盘，重复3次。

在黄瓜播种后30 d取其植株，每个处理选取30株(每个重复10株)，用于测定黄瓜幼苗形态指标和物质积累量指标，计算根冠比和壮苗指数；在黄瓜播种后15 d和30 d取其植株，每个处理选取30株，用于测定黄瓜幼苗生理指标。

1.3.2成株期盆栽试验

盆栽土壤为当地大田草甸黑钙土(土壤基本农化状况：碱解氮量为103.7 mg/kg，速效磷含量为21.4 mg/kg，速效钾含量为189.6 mg/kg，土壤pH为7.88，土壤有机质含量为3.12%)。

盆栽的塑料桶产自河北乾元塑料制品有限公司，塑料桶上口径30 cm，下口径27 cm，高度 30 cm，容积为20 L。将15 kg沙土比例为1∶2(体积比)的混合物装入塑料桶中(距离上口边缘7 cm)，同时每桶均匀混入1.5 g磷酸二胺、4.5 g硫酸钾和 7.5 g 尿素，将土肥混拌均匀并压实。

试验采用盆栽随机区组设计，共6个处理，试验设置同1.3.1，各处理均设置20桶(设为一个小区)，3次重复。小区内部桶之间间隔设为30 cm，各个重复之间间隔距离为70 cm。

2019年4月15日在黑龙江八一农垦大学教学基地塑料大棚内播种，每个塑料桶播种12粒催芽后的黄瓜种子，出苗后选留6 株。播种后每隔2 d浇施一次无菌水，以保持桶内土壤湿润为宜。二叶一心期，每桶留2株幼苗。正常田间管理，及时吊蔓，单蔓整枝，防治病虫害。

果实收获后，每个处理随机选取10个果实，利用果实混合样品测定品质指标；同时，每个处理再随机选取10个果实，进行果实单瓜重测定。

1.4 试验测定指标与方法

1)形态指标测定：株高：植株的茎基部到生长点之间的距离，用直尺测定；茎粗：植株子叶节下1 cm处粗度，用游标卡尺测定；叶面积：用剪纸称重法测定[15]。

2)物质积累量指标测定：利用清水反复冲洗植株，再用吸水纸吸干，按照地上部与地下部分开后测其鲜重；然后将鲜样在105 ℃杀青15 min后，在 70 ℃ 烘至恒重，用1/1 000电子天平分别测定地上部与地下部干重。

根冠比参照段雪婷等[16]计算方法，利用下面公式进行计算：

根冠比=地下部鲜重÷地上部鲜重

(1)

壮苗指数参照刘爽等[17]计算方法，利用下面公式进行计算：

壮苗指数=(茎粗/株高+地下部干重/
地上部干重)×全株干重

(2)

3)生理指标测定：叶绿素含量：丙酮乙醇法[18]；根系活力：α-萘胺氧化法[19]；硝态氮含量：酚二磺酸法[20]；硝酸还原酶(NR)活性：活体分光光度法[21]；可溶性糖含量：蒽酮比色法[22]；可溶性蛋白含量：考马斯亮兰G-250染色法[23]。

4)果实品质指标测定：可溶性糖和可溶性蛋白含量：同3)方法；维生素C含量：碘量法[24]；可溶性固形物含量：阿贝尔折光仪测定法。

5)产量指标测定：单瓜重：用精度为0.01 g的电子天平测定，计算其平均值和标准差；亩产量: 按照每亩地栽培3 000株黄瓜，计算其理论亩产量。

1.5 数据分析

采用Excel 2007软件进行数据处理，用 DPS 7.05 软件进行数据统计和方差分析，不同处理间数据的多重比较采用Duncan新复极差法检验(P<0.05)；采用Excel 2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗形态建成和物质积累指标的影响

由表1可知，在黄瓜播种后30 d，103、104、105、106和107cfu/g棘孢木霉菌剂处理下黄瓜幼苗形态建成指标和物质积累指标均显著高于CK，其中T4即106cfu/g棘孢木霉菌剂处理对黄瓜幼苗株高、茎粗、叶面积、全株鲜重、全株干重、根冠比和壮苗指数促进效果最好，分别比CK提高了72.01%、53.09%、107.59%、99.06%、221.43%、138.18%和212.00%，说明适宜浓度的棘孢木霉菌剂处理对幼苗形态建成和物质积累具有促进作用。

2.2 棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗总叶绿素含量和根系活力的影响

由图1可知，在黄瓜播种后15 d和30 d，棘孢木霉菌剂不同处理下黄瓜幼苗总叶绿素含量和根系活力均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d，黄瓜幼苗总叶绿素含量和根系活力均随处理浓度增加呈先升高后降低趋势，T3即105cfu/g棘孢木霉菌剂处理对黄瓜幼苗总叶绿素含量和根系活力促进效果最好，但T3、T4和T5处理之间差异不显著，T3、T4和T5总叶绿素含量分别比CK增加91.87%、88.12% 和86.70%，而根系活力则分别比CK增加37.41%、36.47%和35.66%。在黄瓜播种后30 d，棘孢木霉菌剂不同处理下黄瓜幼苗总叶绿素含量和根系活力均比播种后15 d有所提高，其中T4促进效果最好，当浓度再升高，总叶绿素含量和根系活力均呈下降趋势。T4总叶绿素含量和根系活力均显著高于T3，T3和T4总叶绿素含量分别比CK增加50.85%和69.08%，而根系活力则分别比CK增加58.21%和74.03%。综上说明，在黄瓜幼苗生长初期，T3对叶绿素和根系活力具有积极的影响；但随着生长周期推移，T4对叶绿素和根系活力的促进作用表现更为明显，为后期产量和品质形成奠定了基础条件。

2.3 棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗叶片可溶性糖含量和可溶性蛋白含量的影响

由图2可知，在黄瓜播种后15 d和30 d，棘孢木霉菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于CK。在黄瓜播种后15 d，棘孢木霉菌剂处理下黄瓜幼苗叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量变化规律与总叶绿素含量变化规律一致，T3促进效果最好，但T3、T4和T5之间差异不显著，T3、T4和T5幼苗叶片可溶性糖含量分别比CK增加125.73%、111.17%和106.91%，而可溶性蛋白含量则分别比CK增加134.16%、128.31%和124.37%。在黄瓜播种后30 d，棘孢木霉菌剂不同处理下黄瓜幼苗叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量均比播种后15 d有所提高但变化规律一致，其中T4促进效果最好。T4可溶性糖含量与T3之间差异不显著，T3和T4可溶性糖含量分别比CK增加70.22%和86.84%；而T4可溶性蛋白含量显著高于T3，T3和T4可溶性蛋白含量分别比CK增加91.64%和140.35%。由此可知，适宜浓度的棘孢木霉菌剂处理对叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量具有明显的促进作用，糖类物质是新陈代谢的主要原料和贮存物质，而可溶性蛋白质含量与植物体总代谢密切相关。

2.4 棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗叶片硝态氮含量和硝酸还原酶(NR)活性的影响

由图3(a)可知，与CK相比，在黄瓜播种后15 d，棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗叶片硝态氮含量增加具有促进作用，其中T3促进作用最显著，但T3、T4和T5之间差异不显著，T3、T4和T5硝态氮含量分别比CK增加168.00%、166.00%和162.00%。在黄瓜播种后30 d，与15 d相比，CK与棘孢木霉菌剂处理黄瓜幼苗叶片硝态氮含量均有所提升。与CK相比，在黄瓜播种后30 d，T4对硝态氮含量促进作用最显著，但T3、T4和T5之间差异不显著，T3、T4和T5硝态氮含量分别比CK增加219.54%、248.28%和235.63%。

CK，无菌水；T1，103 cfu/g棘孢木霉菌剂；T2，104 cfu/g棘孢木霉菌剂；T3，105 cfu/g棘孢木霉菌剂；T4，106 cfu/g棘孢木霉菌剂；T5，107 cfu/g棘孢木霉菌剂。下同。CK， Sterile water； T1， 103 cfu/g T. asperellum agents； T2， 104 cfu/g T. asperellum agents； T3， 105 cfu/g T. asperellum agents； T4， 106 cfu/g T. asperellum agents； T5， 107 cfu/g T. asperellum agents.The same below.图中正负误差线表示标准差大小。不同小写字母表示在同一时期各处理之间差异显著(P<0.05)。下同。Values in the chart are standard error. Different lowercase letters in the same period indicate that the difference reach a significant level (P<0.05)among different treatments. The same below．图1 棘孢木霉菌剂对播种后15 d和30 d黄瓜幼苗总叶绿素含量(a)和根系活力(b)的影响Fig.1 Effect of T. asperellum agents on total chlorophyll content (a) and root activity (b) of cucumber seedlings at 15 and 30 days after sowing

图2 棘孢木霉菌剂对播种后15 d和30 d黄瓜幼苗可溶性糖(a)和可溶性蛋白(b)含量的影响Fig.2 Effect of T. asperellum agents on soluble sugar (a) and soluble protein (b) content of cucumber seedlings at 15 and 30 days after sowing

由图3(b)可知，在黄瓜播种后15 d和30 d，棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗叶片NR活性增加具有促进作用。在黄瓜播种后15 d，与CK相比，T3对NR活性的促进作用最显著，但T3、T4和T5之间差异不显著，T3、T4和T5 NR活性分别比CK增加47.66%、44.89%和43.19%。在黄瓜播种后30 d，与15 d相比，CK与棘孢木霉菌剂处理黄瓜幼苗叶片NR活性均有所提升。与CK相比，在黄瓜播种后30 d，T4对NR活性促进作用最显著，T4显著高于T3，T3和T4 NR活性分别比CK增加34.06%和55.64%。

由此可知，适宜浓度的棘孢木霉菌剂处理对叶片硝态氮含量和NR活性具有明显的促进作用，在黄瓜幼苗播种后30 d即生长后期，T4对硝态氮含量和NR活性有积极影响。而NR是一种限速酶，参与植物氮代谢途径并调节硝酸盐同化，对农作物的产量和品质有着重要的影响；植物叶片硝态氮含量与光合作用关系密切，直接影响光合速率。

图3 棘孢木霉菌剂对播种后15 d和30 d黄瓜幼苗叶片硝态氮含量(a)和硝酸还原酶活性(b)的影响Fig.3 Effect of T. asperellum agents on nitrate nitrogen content (a) and nitrate reductase activity (b) of cucumber seedlings at 15 and 30 days after sowing

2.5 棘孢木霉菌剂对黄瓜品质和产量的影响

由表2可知，103、104、105、106和107cfu/g棘孢木霉菌剂处理下黄瓜果实可溶性糖、维生素C、可溶性蛋白和可溶性固形物含量均显著高于CK。T4处理下黄瓜果实可溶性糖、维生素C、可溶性蛋白和可溶性固形物含量分别比CK增加了78.43%、31.55%、38.47%和8.63%；黄瓜单瓜重和产量分别增加了25.90%和26.20%，说明T4即106cfu/g棘孢木霉菌剂处理对黄瓜果实品质指标促进效果最好。当菌剂浓度再升高，黄瓜品质指标和产量呈下降趋势，说明适宜棘孢木霉菌剂处理对黄瓜品质和产量建成具有促进作用。

3 讨论

木霉在土壤中可以快速传播，长期存活在植物根系表面并分泌多种化合物[25]，对植物生长起到促进作用。许多研究表明，木霉菌不仅能促进幼苗生长，而且可以提高植株生理代谢水平[26]。Pan等[27]研究表明，黄柏(Malus hupehensis Rehd.)施用木霉后的植株鲜重、干重、株高和株径分别提高了186.3%、205.9%、58.8%和33.2%，细根总长度、总细根表面积、总细根体积和细根尖数分别增加147.2%、225.9%、298.5%和331.3%；Myo等[28]研究表明，绿色木霉Tv 911促进了日本芥菜、番茄和萝卜生长，其中芥菜和番茄株高分别提高16.22%和50.26%，而萝卜鲜枝和根重分别增加了23.83%和58.86%。这是因为木霉通过调节植物生理生化代谢过程，影响植物幼苗的生长状态[29]，从而具有促进植物生长的作用[30]，这些作用的发挥与根系活力和叶绿素密切相关[31-32]。朱忠彬等[33]研究发现，短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)DZQ3能够诱导烟草的根系活力，提高叶绿素含量。经过DZQ3处理后烟草的根系活力和叶绿素含量分别高出对照 38.34%和17.03%；烟株鲜重比对照增加38.48%，各生长期相比于对照均表现出一定的生长优势。宋玉娟[34]研究发现，烟草经过1×108spores/mL棘孢木霉处理后，烟草叶绿素含量和根系活力比对照分别增加了57.46%和50.82%。本研究发现，棘孢木霉菌剂对黄瓜幼苗形态建成和物质积累均有不同程度的促进作用，叶绿素含量和根系活力分别高出对照69.08%和74.03%，与前人研究结果相类似。

在高等植物中，渗透调节物质如可溶性糖和可溶性蛋白质可有效维持植物体细胞渗透平衡，提高植物生物抗性[35]。本研究结果发现，棘孢木霉菌剂对黄瓜叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量均有不同程度的积极影响，一方面这些物质可作为营养物质促进植物的生长；另一方面它们还可作为细胞内重要的渗透调节物质，起着调节细胞渗透平衡、增强细胞结构稳定性和减少组织氧自由基产生的重要作用[36]。因此这些物质含量的提高，可以增强细胞的持水力，稳定蛋白结构，减少植物胁迫条件下细胞的致死机会[37]。植物叶片硝态氮含量是作物氮素同化和利用的主要指标，NR的活性高低直接影响植物体对氮素营养的利用效果，对作物品质和产量也会产生一定的影响[38]。本研究表明，棘孢木霉菌剂处理能通过促进黄瓜对硝态氮的吸收，提高硝态氮的含量，而NR活性与硝态氮的变化呈现正相关的关系，硝态氮含量增加，NR活性也随之增加[39]，从而促进植物同化和还原氮素，利于黄瓜产量和品质的形成。

根系作为植物的主要器官之一，具有吸收、分泌和感知等多种重要的生理功能[40]，因此，强大的根系对作物产量和品质形成具有重要的积极意义，而根系具体形态指标的变化规律直接影响植物的生长状态。周晓馥等[41]研究发现，哈茨木霉菌液灌根处理的黄瓜幼苗植株，光合参数均有显著提高，根系形态学指标如根尖数、分支数和交叉数也明显髙于对照组植株，表现出了其根系庞大，分支较多的特点；其总根体积和总根表面积也较对照组有了明显增加，总根体积和总根表面积的增加有利于根从更广阔的土壤中获取养分和水分，此结果与胡洁等[42]研究得出哈茨木霉通过增强根系活力来达到对茄子幼苗的促生作用相一致，说明哈茨木霉能够通过对根系的影响来促进植株的生长发育。本研究中仅对根系鲜重、根系干重和根系活力进行了研究，在后续试验中，将对根长、根表面积和根生长速率等相关指标进行监测，进一步充实棘孢木霉菌剂对黄瓜生长的促生机理。