基于网络药理学与分子对接探讨康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的分子作用机制

刘 倩 张 静 韩福国 范雪梅 郝艳丽 史 云 刘清飞*

1.陕西中医药大学药学院(咸阳，712046)；2.清华大学药学院；3.北京中医药大学东直门医院

在中医理论体系中，宫颈HPV感染属于“带下病”,用药方面通过内服清热利湿解毒类药物直接清除病毒和提高免疫力达到治疗目的或通过外用药改善局部免疫环境而协助机体清除病毒[1]。康妇凝胶为中药制剂，局部涂抹给药，其由白芷、蛇床子、花椒、土木香、冰片5种中药材组成，可抗病毒又可提高免疫[2],临床已用康妇凝胶治疗宫颈HPV感染[3]，但分子作用机制尚无深入研究。网络药理学是从系统和网络整体层面解释药物系统药理机制的一门交叉学科，与中医药的“网络靶标-多成分药物”及整体性特点不谋而合[4-6]。本文运用网络药理学及分子对接技术探讨康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的复杂网络关系，明确其药效物质基础及分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要网络数据库及软件

TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM等活性成分预测数据库；OMIM、GeneCards、DisGeNET等疾病靶标数据库；Uniprot、RCSBPOB等靶点信息数据库DAVID、微生信、DEGG、String、Cytoscape 3.7.2、KNIME 4.3.1、Autodock vina、pymol、Chem 3D等结果分析软件。

1.2 活性成分及靶点筛选

分别以白芷、蛇床子、花椒、冰片、土木香为关键词在TCMSP中检索其活性成分和相关靶点。口服生物利用度(OB)主要用于口服药物，而康妇凝胶给药方式为局部涂于外阴、阴道处，经黏膜吸收而发挥药效。药物透过黏膜后能够迅速入血，经血液循环到达全身或靶点，无需经过肝脏，一定程度上能够提高药物生物利用度[7]，因此本文在TCMSP中以类药性DL(Drug Likeness)≥0.18为筛选标准检索活性成分及靶点，并在Pubchem得候选成分的SMILES字符串，导入SwissTargetPrediction平台，设置属性为”homo sapiens”，选取Probability≥0.85全部预测靶点或Probability≤0.85的前15个蛋白靶点作为该成分有效预测靶点。用BATMAN-TCM数据库按Score cutoff≥20且P-value<0.05检索土木香的活性成分及对应靶点。结合Uniprot，校正得到中药活性成分相关靶点。

1.3 宫颈HPV感染相关靶点筛选

通过OMIM、GeneCards、DisGeNET数据库，以“Cervical HPV Infection”“Cervical Human Papillomavirus Infection”与“Cervical Human Papilloma Virus Infection”为检索词进行检索，对检索结果进行整合去冗余后获得宫颈HPV感染相关靶点。

1.4 宫颈HPV感染的潜在作用靶点筛选

运用微生信平台绘制韦恩图，取康妇凝胶活性成分作用靶点与宫颈HPV致病相关靶点的交集，作为康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的潜在作用靶点。

1.5 PPI网络与可视化网络的构建

将1.4潜在作用靶点导入String数据库，以物种“Homo sapiens”、高可信度≥0.7作为筛选条件，得蛋白间相互作用关系，再运用Cytoscape(3.7.2)进行可视化，根据网络中度值、介度、紧密度等进行排序，筛选核心靶点。

1.6 GO生物过程与KEGG通路富集分析

将潜在作用靶点基因导入DAVID数据库进一步分析其相关生物过程及作用通路，富集结果按P值由小到大(P<0.05)排序，GO分析选前10个结果，KEGG选前20个通路进行分析和展示。运用KEGG数据库进行注释以及通路图分析。

1.7 “药物成分-作用靶点-作用通路”网络图

运用KNIME软件获得前20条通路相关靶点对应的化学成分，得到活性成分-通路相关靶点-通路对应关系，导入Cytoscape构建“药物成分-作用靶点-作用通路”网络图，根据度值筛选主要活性成分。

1.8 分子对接

采用Autodock vina软件对排名前5的核心靶点与1.7中对应活性成分进行分子对接验证。从RCSB PDB蛋白质结构数据库得靶点蛋白三维结构并保存为pdb格式，Pubchem数据库导出化合物三维结构SDF格式，在chem3D中转化成mol2格式。采用AutoDock Tools对上述蛋白受体进行去水加氢、计算电荷后存为pdbqt格式。再运用插件Autogrid得到活性口袋，进行分子对接，最后用pymol可视化分析。

2 结果

2.1 康妇凝胶活性成分筛选

TCMSP、BATMAN-TCM数据库中共筛选得到来自白芷、蛇床子、冰片、花椒、土木香的活性成分数量分别为45、29、5、8、4个，潜在作用靶点整合去重后得到512个。

2.2 宫颈HPV感染相关靶点基因筛选

从OMIM、GeneCard、DisGeNET疾病基因数据库分别检索得261、1913、429个宫颈HPV感染相关靶点，整合去重得2275个。

2.3 康妇凝胶治疗宫颈HPV潜在作用靶点筛选

将活性成分作用靶点与宫颈HPV致病相关靶点导入微生信在线平台得交集靶点，如图1所示(2725页)，交集基因239个，占总基因数的9.4%，为康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的潜在作用靶点。

2.4 潜在作用靶点蛋白相互作用(PPI)网络分析

在String数据库导入239个潜在作用靶点进行PPI网络分析，结果用Cytoscape可视化，包含229个靶点、2315条边。以度值≥2倍中位数即度值≥30筛得54个候选靶点，进而以度值、介度、紧密度≥中位数筛选出22个核心靶点，见图2(2725页)，其中颜色越深表明degree值越大。

2.5 交集靶点富集分析

2.5.1 GO分析通过DAVID进行GO功能富集分析，得显著性GO条目835个，其中生物过程(BP)条目643个，细胞组成(CC)条目72个，分子功能(MF)条目120个，分别占77.0%、8.6%、14.4%。图3(2725页)为BP、CC及MF富集结果中显著性最高的10条功能。BP方面主要参与对药物的反应性、凋亡过程负调控、蛋白质磷酸化等；CC方面主要参与胞质溶胶、细胞外空间、核质等；MF方面主要参与蛋白激酶活性、酶结合、蛋白结合等，表明康妇凝胶参与体内多种生物学调控过程以发挥防治HPV感染的作用。

2.5.2 KEGG分析239个潜在作用靶点经DAVID通路富集分析得126条显著富集通路，运用KEGG数据库进行通路注释分析，结果见图4(2725页)。潜在作用靶点显著富集的信号通路有PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、TNF、ErbB等信号通路。根据现有与宫颈HPV感染相关的作用机制研究[8-12]，在富集得126条通路中选择与宫颈HPV感染最为相关的5条信号通路进行整合，构建了康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的信号通路调控网络图，见图5(2726页)。

2.6 “药物成分-作用靶点-作用通路”网络构建

KNIME得20条通路136个相关基因对应80个活性成分，导入Cytoscape中构建“药物成分-作用靶点-作用通路-疾病”网络图，见图6(2726页)。该网络涉及236个节点和1197条边，平均度值为6.09，大于平均度值的活性成分共有20个(表1)，提示这20种成分可能为康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的主要活性成分。其中槲皮素、(E)-2,3-二(7-甲氧基-2-氧代-8-色烯基)丙-2-烯醛、黄木亭、β-谷甾醇和二氢欧山芹醇醋酸酯为度值最高的5个活性成分。

表1 康妇凝胶20个核心成分相关参数

2.7 分子对接

为了验证网络药理学预测结果的准确性，将排名前5的核心靶点(TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1、EGFR)与其对应主要活性成分进行分子对接，部分结果见表2，部分可视化结果见图7(2726页)。靶点与活性成分的结合能越小越好，结合能<-5kJ/mol，表明二者具有较好的结合活性，<-7kJ/mol表明二者的结合构型有强烈的结合活性。核心靶点均与对应活性成分大多形成氢键且均有较好的结合活性。其中，槲皮素与TP53以及EGFR结合作用最强，均为-8.0kJ/mol，HSP90AA1与多数活性成分均有较好对接作用。不同靶点作用相同化学成分，不同化学成分又可作用相同靶点，充分提现了康妇凝胶能够多成分-多靶点治疗宫颈HPV感染。

表2 核心靶点与部分对应活性成分对接结合能及氢键数

3 讨论

HPV感染较为广泛，女性一生有70%～80%可能性感染HPV[13]。本文通过网络药理学和分子对接技术预测了康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的药效物质基础及分子作用机制。数据库筛选得91个活性成分以及239个作用靶点，再通过网络图及分子对接实验证实槲皮素、β-谷甾醇等化学成分可能为治疗宫颈HPV感染的化学成分。槲皮素是花椒中一种黄酮类化合物，已研究出其抗炎，抗癌等作用[14]。在单层细胞培养中槲皮素可抑制多种病毒对细胞的感染，可通过拮抗宿主细胞的Ca2+通道阻止病毒进入细胞而达到抗病毒作用，还可抑制病毒在细胞内复制[15]。另一方面也可以通过刺激细胞内信号转导通路调控机体的炎症反应以及免疫应答[16]。β-谷甾醇是白芷、花椒、蛇床子的共有成分，可通过促进IFN mRNA表达并促进其下游相关抗病毒基因表达发挥抗病毒作用[17]。

通过PPI网络拓扑学参数筛选得TP53、AKT1、STAT3、HSP90AA1和EGFR可能为康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的核心靶点。p53是一种肿瘤抑制基因，高危HPV E6蛋白可直接作用于p53核心位点，导致其介导细胞周期停滞和凋亡功能丧失[18]，而低危HPV由于E6蛋白只分布于细胞核内，将p53隔于细胞质中，不能靶向降解p53。这也使高低危HPV在降解p53时有差异性[19]。高危HPV E6可通过IL-6异常升高激活STAT3转录因子而使细胞癌变[20]。HSP90蛋白可作为分子伴侣与癌症基因DNA结合，激活其抗肿瘤作用，有研究已验证HPV16 E7与HPS90融合制成的DNA疫苗可促进宫颈癌细胞凋亡也可直接杀伤癌细胞发挥抗肿瘤作用[21]。宫颈癌病变部位的表皮生长因子受体(EGFR)高表达且表达水平与HPV感染复发有密切关系[22]。有研究表明EGFR抑制剂TK1可抑制EGFR和AKT磷酸化作用以及阻断JAK/STAT通路进而抑制宫颈癌HeLa细胞增值[23]。

GO结果显示这些靶点基因可通过参与对药物的反应性、凋亡过程负调控、蛋白质磷酸化等生物过程；影响胞质溶胶、细胞外空间、核质等细胞部分；调控蛋白激酶活性、酶结合、蛋白结合等分子生物功能协同发挥抗宫颈HPV感染的作用。KEGG富集分析结果表明康妇凝胶治疗宫颈HPV感染涉及PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、TNF信号通路及ErbB信号通路等相关通路，展现出康妇凝胶治疗宫颈HPV感染“多靶点、多通路”的特点。其中最为主要的通路为P13K/Akt信号通路，AKT1既是通路中的关键分子也是康妇凝胶潜在作用靶点。有研究表明，HPV16感染与PI3K、AKT1、NF-κB表达成正相关，持续感染可以导致PI3K-AKT信号通路被激活，进一步导致宫颈病变[8]。真核细胞自噬功能可降解自身受损蛋白质和细胞内病原体，因此在防御病毒感染方面起重要作用。HPV 16感染角质细胞后E6/E7蛋白同时表达可通过激活PI3K/AKT/mTOR通路而抑制自噬功能[24]。但也有研究表明，HPV11 E6蛋白过表达也可抑制AKT/mTOR和Rrk/mTOR通路而激活自噬[25]。有研究将HPV11 E6和HPV18 E6基因克隆于HaCaT细胞中表达，发现HPV11 E6和HPV18 E6蛋白通过调节PI3K/AKT通路以及其他DNA损伤修复、细胞存活、增值等通路启动细胞转化。虽HPV11和HPV18的E6蛋白有相似的影响，但高危HPV18E6的水平明显要高很多[26]。

综上可述，本研究运用网络药理学及分子对接技术揭示了康妇凝胶治疗宫颈HPV感染的活性成分、作用靶点以及分子作用机制，体现其多成分、多靶点、多途径协同作用的特点。随着对网络药理学所涉及的数据库、方法、应用不断完善，网络药理学在揭示中药物质基础与分子作用机制方面的优势必将更加明显[27-28]，特别是针对当前网络药理学研究尚存在数据缺乏标准化、科学验证不足等问题，2021年，首个网络药理学国际标准正式制订并发布[29]，必将进一步促进网络药理学研究的专业化、标准化以及广泛应用。