携ICAM-1靶向超声造影评估动脉粥样硬化兔心肌微循环的实验研究

金 琳，李 萍，钮培玉，王 欢

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery atherosclerotic heart disease，CAD)简称冠心病，在我国发病率呈逐年升高趋势，心血管高危因素，如高血压、糖尿病、高脂血症等导致亚临床心脏受累，早期发现心脏功能损害，对降低心血管病病人死亡率和延长寿命具有重要的临床意义[1]。实时心肌声学造影(myocardial contrast echocardiography，MCE)可显示心肌微循环[2]。本研究应用携细胞间黏附分子-1(ICAM-1)靶向超声造影剂评估动脉粥样硬化兔心肌微循环，旨在探讨其应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 选取雄性新西兰大白兔16只，体质量(2.14±0.13)kg，4～5个月龄，均购自上海市甲干生物科技有限公司，随机分为对照组及动脉硬化组，各8只。对照组给予普通饲料，动脉硬化组给予高脂饲料，两组实验兔饲养12周。高脂-胆固醇饲料成分包括普通饲料75.5%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇4%、胆盐0.5%。USphereTM超声微泡购自南京云桥生物技术有限公司，ICAM-1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 实验仪器及设备 配备具有造影功能的超声诊断仪(Toshiba Aplio800)，设置探头频率为9～18 MHz；UltraMix振荡器；涡旋震荡仪Vortex-QL-861。

1.3 携ICAM-1单抗靶向超声微泡的制备 以生物素亲和素链接法制备携抗ICAM-1超声靶向微泡。应用UltraMix振荡器(频率200次/min)将标记亲和素的USphereTM超声裸微泡及Biotin/FITC-ICAM-1抗体涡旋震荡，充分混悬10 s后置于室温下孵育30 min，离心去除多余抗体，流式细胞仪检测Biotin/FITC-ICAM-1与微泡的结合率。

1.4 常规超声心动图检查 取左心室乳头肌水平短轴切面，M型超声心动图记录前间隔、左室后壁运动曲线，测量室间隔舒张期厚度(IVS)和左室后壁舒张期厚度(LVPW)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)，计算左室射血分数(LVEF)，每只实验兔测定3个心动周期，取平均值。

1.5 MCE方法 实验兔肌肉注射0.1 mL/kg的速新眠进行麻醉，仰卧位于操作床上，剔除腹部毛发，于耳缘静脉置入留置针。16只实验兔选择左心室乳头肌水平短轴切面行MCE检查，超声探头频率为18 MHz，深度1 cm，帧频45帧/s，机械指数0.08，造影过程中保持各参数不变，微泡造影剂以0.15 mL/(kg·min)连续缓慢注射，之后注射1 mL生理盐水冲洗。待心肌造影剂回声强度达到稳定状态时，发射连续10帧的高能量声束，心肌内微泡完全破坏后，切换为实时造影模式，获得心肌再灌注的实时动态图像。根据美国心脏病学会推荐的16节段分析法，将左心室乳头肌水平短轴切面分为前壁、前间隔、后间隔、下壁、后侧壁和前侧壁6个节段，将感兴趣区(region of interest，ROI)置于6个节段中央，取样大小尽量包括整个心肌厚度，避免心内膜和心外膜干扰，对心肌再灌注图像分析时间-强度曲线，获取参数达峰强度(peak intensity，PI)、达峰时间(time to peak，TTP)，整体心肌血流灌注参数取各节段平均值。

1.6 实验室及病理检查 经耳中动脉采集空腹血5 mL，检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。心肌造影完成后处死实验兔，乳头肌水平垂直于心脏长轴取左室心肌，行苏木精-伊红(HE)染色。

2 结 果

2.1 两组血脂和常规超声心动图指标比较 动脉硬化组TG、TC、HDL-C及LDL-C均高于对照组(P<0.01)；两组心率、IVS、LVPW、LVESD、LVEDD及LVEF比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 两组血脂和常规超声心动图指标比较(±s)

2.2 实验兔MCE结果 左室乳头肌水平短轴切面MCE显示，两组实验兔心肌血流灌注呈均匀一致性，未见明显心肌节段性灌注缺损。观察3 min后，对照组兔心肌内造影剂已消退不显影，动脉硬化组兔可见少量造影剂持续显影。详见图1。整体心肌灌注分析显示，动脉硬化组PI低于对照组，TTP晚于对照组(P<0.01)。详见表2。

图1 两组实验兔MCE图像

表2 两组心肌灌注参数比较(±s)

2.3 实验兔心肌组织病理结果 HE染色结果显示：动脉硬化组及对照组心外膜下冠状动脉及心肌内小动脉均无明显粥样硬化斑块形成。对照组兔心肌细胞形态、排列及间质未见明显异常，动脉硬化组兔心肌细胞可见脂肪变性。详见图2。

图2 两组实验兔心肌组织HE染色图

3 讨 论

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要病理学基础，与心肌梗死、心力衰竭等心血管不良事件发生呈正相关[3]。CAD基本病理机制是冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉血流下降[4]，局部心肌血流灌注降低和心肌功能异常。

慢性动脉粥样硬化中，心肌微血管在不伴有冠状动脉粥样硬化时即出现内皮功能损害，大动脉内皮功能损害可能出现在明显的病理改变之前[5-6]，心肌微血管内皮功能不全导致血管舒缩功能异常，从而导致心肌灌注下降。冠状动脉微循环疾病临床表现无特异性，早期识别及正确评估心肌灌注异常对预防和治疗疾病具有重要的临床意义。

MCE是一项无创性评价心肌血流灌注的影像学技术，可实时、准确、定量分析心肌血流灌注[7]。MCE临床研究显示，局部心肌血流灌注异常早于心功能异常[8]。靶向超声造影剂作为一种分子显像剂，造影剂微泡通过配体的靶向作用，可构建主动性靶向超声微泡，特异性聚集于组织器官靶点，增强局部显影效果，提高病变检出率和诊断精确性[9]。内皮细胞功能障碍过程中，ICAM-1等炎性因子表达上调，可作为靶向超声成像测定的靶点[10]。携ICAM-1微泡对损伤血管内皮的靶向性，使用超声显像可无创评估炎症或内皮损伤部位。

MCE检查造影剂灌注量与心肌微循环呈正相关，增强强度越高，提示心肌微循环越好[11]。本研究中动脉硬化组兔心肌灌注降低，考虑是心肌微循环减少。ICAM-1靶向造影剂增强强度不仅可反映心肌微循环情况，且与靶向显影作用相关。本研究应用ICAM-1靶向造影剂发现，动脉硬化兔心肌造影剂PI降低，TTP均晚于正常实验兔，表明CAD心肌微循环减少，ICAM-1表达增高，ICAM-1微泡聚集并停留于内皮损伤明显节段，超声显像可显示微泡回声，从而得到无创评估微循环障碍部位及严重程度。因此，心肌缺血时靶向造影剂MCE检查对血管内皮损伤敏感性较高，其显示的心肌灌注异常早于传统超声心动图显像。

综上所述，携ICAM-1靶向超声微泡可敏感地对动脉粥样硬化兔心肌微循环障碍进行靶向性诊断，作为CAD早期诊断和动态疗效监测的有效方法，具有一定的临床意义，同时为CAD靶向治疗提供了一定的可行性，今后实验研究可进一步证实该结论。