四川省烟草靶斑病病原鉴定及生物防治研究

徐传涛，张 崇，张明金，谢 强，彭 勇，张永辉，夏建华，夏 春，夏 博，顾 勇，吴元华

（1.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110161；2.四川省烟草公司泸州市公司，四川 泸州 646000）

烟草是四川省重要的经济作物之一，全省常年种植面积约8 万hm2。近年来，由于烟区气候条件的变化，烟草新病害在四川省烟区时有发生。烟草靶斑病是近年来在四川省烟区新发生的一种病害，其具有发生面积广、病害传播迅速、经济损失巨大等特点。烟草靶斑病是由瓜亡革菌［Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk］、无性世代为立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKühn）的病原物引起的真菌病害［1］。该病是由 COSTA 于 1948 年在巴西首次发现并报道［2］，此后哥斯达黎加、美国、南非、津巴布韦也相继报道了该病害的发生［3-6］。吴元华等［7］在辽宁省烟区首次发现并报道了烟草靶斑病在中国的发生与危害。此后，广西［8］、云南［9］等烟区相继报道烟草靶斑病的发生。2018 年在对四川省烟草病害调查时发现，四川省泸州市古蔺县和叙永县各乡镇烟草种植田块靶斑病大面积发生，一般田块减产15%～20%，严重田块减产高达90%以上，Xia 等［10］首次报道了该病害在四川省的发生。本研究进一步对四川省泸州市各烟草种植乡镇采集病样，对其病原菌进行分离鉴定，并明确其菌丝融合群类型，同时选用几种生物农药开展田间防治试验，以期为烟区有效控制病害的发生蔓延提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 样本为2018 年和2019 年采自四川省泸州市古蔺县和叙永县各乡镇烟草种植田块，经分离纯化得到41 株菌株（表1）。立枯丝核菌标准菌株由沈阳农业大学植物保护学院病毒室保存（AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8 和 AG-9）。

表1 病原菌分离株及其采集地点

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，去离子水1 000 mL

1.1.3 供试品种 云烟87。

1.1.4 供试药剂 10%井冈霉素水剂、105亿CFU/g多粘·枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、10 亿CFU/g 海洋芽孢杆菌可湿性粉剂、100 亿CFU/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，辽宁省沈阳红旗林药有限公司；3%多抗霉素水剂，辽宁省沈阳中科生物工程有限公司；40%菌核净可湿性粉剂（对照药剂），一帆生物科技集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定 在新采集的病叶上，选取典型的单个病斑，从病斑边缘或病健交界处分离病原菌，将病原菌置于25 ℃培养箱内恒温培养1～2 d。待菌丝长出后，参照鉴定标准［11］，对病原菌进行鉴定。切取单枝菌丝尖端，置于PDA 斜面上进行单菌丝分离与纯化培养，以获得该菌株的纯培养物，并对样品进行编号保存。

1.2.2 病原菌致病性测定 采用柯赫氏（Koch）证病规则进行接种试验，将纯化后的病原菌在PDA 培养基上培养3 d，菌落边缘打取直径6 mm 菌饼，针刺接种于经75%乙醇表面消毒后的云烟87 烟草叶片上，采用无菌水浸湿脱脂棉覆膜保湿，以直径6 mm的PDA 琼脂块接种云烟87 烟草叶片作为对照，每处理15 片，3 次重复。接种3 d 后移除菌丝块，观察叶片发病情况，再次于病健交界处分离病菌，与接种病原菌进行形态比较。

1.2.3 菌丝融合群的鉴定 采用玻片配对法进行鉴定，将待测菌株分别与各融合群标准测试菌株配对，进行融合观察。

1.2.4 田间病害防治

1）试验设计。2019 年试验地点为泸州市叙永县营山镇，土壤肥力均等；每种药剂设置1 个处理，即：A.10%井冈霉素水剂（稀释800 倍）；B.105亿CFU/g 多粘·枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（稀释500倍）；C.10 亿CFU/g 海洋芽孢杆菌可湿性粉剂（稀释500 倍）；D.100 亿 CFU/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（稀释500倍）；E.3%多抗霉素水剂（稀释500倍）；F.对照药剂40%菌核净可湿性粉剂（稀释600 倍）；G.以等量清水处理为空白对照。每个处理120 株，重复3次。间隔7 d 施药1 次，共计施药2 次。

2）调查方法。第2 次施药7 d 后，每小区采用5点取样方法，每点调查10 株，记录调查总株数或总叶片数及各级病叶数，进行病害分级。

烟草靶斑病病情分级标准［11］：0 级，无病；1 级，病斑面积占叶片面积的1%以下；3 级，病斑面积占叶片面积的1%～10%；5 级，病斑面积占叶片面积的11%～30%；7 级，病斑面积占叶片面积的31%～50%；9 级，病斑面积占叶片面积的51%以上。

病情指数=100×∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

3）数据处理。采用 SPSS 22、Excel 2019 进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 立枯丝核菌的分离与鉴定

从四川省泸州市各烟草种植区采集的烟草靶斑病样品上分离纯化得到41株菌株，其形态与Parmeter等［12］对立枯丝核菌的描述相符合。如图1 所示，菌丝粗壮、有分隔，直径为7～12 μm。初生菌丝粗壮，最初与主枝夹角约45°，随着菌丝老熟变为棕黄至褐色，菌丝间夹角约为90°，分枝处有明显缢缩，且有隔膜与母菌丝隔开，染色结果表明，菌丝细胞为多核。综合镜检和培养菌丝形态观察，认为该病原菌为立枯丝核菌，属半知菌门无胞菌目丝核菌属。

2.2 致病性测定

接种3 d 后观察症状与田间症状基本一致。即初侵染病斑为水渍状，病斑直径为0.5～2.0 cm 且不规则，病斑内几乎透明，有同心轮纹，并形成退绿晕圈，病斑坏死，部分有穿孔。在叶片背面，有的是叶片正面的病斑边缘，着生呈奶油色至灰白色的子实层和担孢子。自病健交界处再次分离获得病原菌。经镜检与菌丝融合测定，结果表明，再次分离获得病原菌与原接种菌株相同的病原菌（图2）。

图1 烟草靶斑病病原菌菌落及菌丝

图2 接种烟草靶斑病菌5 d 后症状

2.3 立枯丝核菌菌丝融合群测定

采用玻片配对法测定供试菌株菌丝融合群，试验结果（图3）表明，供试菌株全部与AG-3 标准菌株融合，即两菌丝接触细胞间细胞壁溶解，细胞质相互融合，细胞核流入另一菌丝内；却不与AG-1-IA、AG-2-1、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9 等标准菌株融合。表明四川省泸州市烟区采集到的烟草靶斑病病原菌即立枯丝核菌应归入AG-3 融合群。

图3 菌丝融合反应

2.4 田间防治效果

5 种生物药剂对烟草靶斑病的田间防治效果（表2）表明，10%井冈霉素水剂防治效果最好，可达77.08%，明显优于供试对照药剂40%菌核净可湿性粉剂；10 亿CFU/g 海洋芽孢杆菌可湿性粉剂和105亿CFU/g 多粘·枯草芽孢杆菌可湿性粉剂次之，防效分别达69.40%和63.75%，二者差异不显著，但也明显优于供试对照药剂40%菌核净可湿性粉剂；其他几种药剂防治效果不理想。

表2 不同药剂对田间烟草靶斑病的防治效果

3 小结与讨论

通过对病原菌的分离鉴定，表明泸州市烟区的烟草靶斑病病原菌均为瓜亡隔菌，无性世代为立枯丝核菌，病害田间症状由于易与赤星病、野火病混淆，极易造成误诊。据报道，适宜的温度，较高的相对湿度、烟叶叶片长时间处于湿润条件有利于病害的发生、流行。经调查，泸州市烟区近年来8—9 月连续阴雨，气温偏低、空气湿度大、清晨易出现叶片结露现象，此条件与北卡罗来纳州靶斑病大发生的气候特点相似［12］。

样品来源的不同对烟草靶斑病病原菌的融合群构成存在一定影响。国外报道指出，采自美国北卡罗来纳州的病菌属于AG-2-2 融合群［13］，而采自美国康乃迪克州、马萨诸塞州的病原菌菌株属于AG-3 融合群［14，15］。国内报道采自辽宁省丹东市和铁岭市、黑龙江省、云南省烟区的病原菌菌株属于AG-3融合群［9，16，17］，国内首次从广西省烟区烟草靶斑病组织上分离到 AG-2 和 AG-4 融合群［8］。本研究从四川省泸州市烟区各地分离得到的烟草靶斑病菌，经过菌丝融合群测定均为AG-3 融合群。

生物防治是一种高效、安全的防治植物病害的方法，具有对人畜安全、环境兼容性好、保护生物多样性、不易产生抗性及来源广泛等优点。为此本研究选用市售5 种生物药剂对田间烟草靶斑病进行防治试验，结果表明，10%井冈霉素水剂对田间病害的防治具有显著效果，防效可达77.08%，其次为10 亿CFU/g 海洋芽孢杆菌可湿性粉剂、105亿CFU/g 多粘·枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，防效分别为69.40%、63.75%。因此，可在生产上选用以上3 种药剂防治烟草靶斑病。