植物环核苷酸门控离子通道的研究进展

王欣悦，刘培源，余冰清，张艳峰，丁百香，严汉池

（天津大学生命科学学院，天津 300072）

环核苷酸（CNMPs）是一类重要的信号分子，如3′，5′-环磷酸腺苷（cAMP）和 3′，5′-环磷酸鸟苷（cGMP）是动植物生命活动中信号通路的重要元件［1］。在动物中，细胞受外部信号刺激从而激活胞内嘌呤核苷酸环化酶（NCs），催化其底物核苷酸三磷酸合成CNMPs。胞内CNMPs 可由磷酸二酯酶（PDEs）代谢分解为非活性的单磷酸核苷［2］。动物中CNMPs 信号传递的主要分子开关有CNGCs 和超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCNs）［3］。

植物中CNMPs是通过质谱分析法首次被发现［4］。研究证明，CNMPs 在调节植物发育和抵御胁迫反应中起重要作用，但其分子机制还需要进一步研究［5］。在植物蛋白质提取物中可检测到PDE 活性［6］，但目前并不能通过基因水平证明植物中存在PDE 同系物。此外，尽管有一些研究表明植物中CNMPs 可以激活一些蛋白酶［3，7］，但仍缺乏生理生化分析，试验存在争议。还有猜测CNMPs 可作为基因启动子中的特定调节元件［8］。目前，环核苷酸门控通道已被证实含CNMP 绑定结合域，是植物细胞CNMPs 调控的主要分子开关。已知存在两类CNMP 绑定结合 域 ，即 GAF［9］（mammalian cGMP-binding PDEs，Anabaena adenylyl cyclases（ACs），E. coliFhlA）和环核苷酸结合域（CNMP-binding domain，CNBD）。研究表示，CNMP 绑定结合域可能不局限于GAFs 和CNBDs，通过对植物CNMP 相互作用组分析，发现了一种完全不同于已知的CNMP 绑定结合域的蛋白质组，说明植物CNMPs 可能调控下游多个信号通路，参与多种联级反应［10］。目前，已知植物CNMPs 调节下游效应蛋白的有蛋白激酶、cAMP 激活的交换蛋白（EPAC）和环核苷酸门控离子通道（CNGCs）。其中，CNGCs 是主要的研究对象。CNGCs 是普遍存在植物细胞中非选择性阳离子通道和分子开关，可将胞内环核苷酸信号转导为节律性调控离子波动的信号以及调控细胞各种生理反应，参与植物的生长和发育过程，以及抵御各种胁迫反应。

在大麦糊粉层表达文库中筛选钙调蛋白（CaM）时，首次发现植物CNGCs家族基因［11］。随后，在其他植物中也发现了CNGCs［12-15］，如拟南芥（Arabidopsist⁃haliana）、水稻（Oryza sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、梨（Pyrus bretschneideri）、抱子甘蓝（Brassica oleracea）、小麦（Triticum aestivum）、枣树（Ziziphus jujubaMill.）等。根据CNGCs 氨基酸序列相似度及功能可以分为多个亚家族。如拟南芥CNGC 家族根据系统发育关系被细分为5 个亚家族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa 和Ⅳb）［16］。TaCNGCs 被分为 4 个亚家族Ⅰ～Ⅳ［17］。目前对于植物CNGCs 的基因组特征、系统发育比对研究较为清楚。随着对植物CNGCs 的深入研究，其生理学作用及调控分子机制有了进展和突破，建立了CNGC 分子调控新模型［18-20］。

本研究从植物环核苷酸门控离子通道的分子结构特性、调节和离子选择性以及功能进行了详细综述，总结植物环核苷酸门控离子通道在植物生长发育以及胁迫反应的新进展，对今后植物环核苷酸门控离子通道的研究方向进行展望，以期为植物环核苷酸门控离子通道研究提供参考。

1 植物CNGCs 的结构特征

植物CNGCs 与Shaker 型K+受体电压门控通道结构相似，其N 末端和C 末端都在质膜内侧，有6 个跨膜区（S1～S6），其中S4 为带正电荷的跨膜区，在S5和S6 之间有参与离子门控的P 环。对梨和拟南芥CNGCs 结构的研究发现，S4 为电压传感器样功能域并且在该基序中具有许多带正电荷的残基，表明植物的CNGCs 具有微弱的电压传感器功能。用电生理学分析验证了CNGC 是电压门控的离子通道［21］。P 环无规则卷曲的部分影响通道离子的选择性和电导，这一点与对离子无选择性的动物CNGCs 不同。植物CNGCs 的C 末端含有高度保守的CNBD，CNBD的 αC 螺旋即 CaMBD 可结合 CaM，而动物 CNGCs 的CaMBD 位于 N 端，二者不同［14，22］，如图 1 所示。植物CNBD 序列不同于动物离子通道，包含绑定环核苷酸配体磷酸根和糖的磷酸盐结合域（PBC），以及影响配体的选择性和结合亲和力的hinge 域［15］。CaMBD 位于 CNBD 的 C 端，二者重叠部分使 CaM 与CNMPs 竞争结合CNGC，从而引起通道蛋白的构象和状态改变。研究发现AtCNGC20 与CaM 结合是通过独特的异亮氨酸-谷氨酰胺即IQ 基序，且该基序与CNBD 的α-螺旋相邻但不重叠［23］。经进一步的研究发现，AtCNGCs 家族部分成员也含有IQ 基序［11］。此外，AtCNGC11/12 的 IQ 位点域通道的功能紧密相关，当IQ 基序位点突变会破坏通道与CaM 结合，导致部分或全部通道功能丧失［24］。此外，位于核心IQ 序列N 端2 个丙氨酸残基对结合CaM 起重要的决定作用。通过对20 个AtCNGCs 的IQ 序列酵母双杂交（Y2H）分析，结果显示只有部分IQ 序列与钙调素保守结构域相互作用。IQ 基序的近端和远端区域均不能与CaM 发生相互作用，这一发现表明CaM 的结合能力很可能取决于 IQ 基序位置［18］。

2 植物CNGCs 离子选择与调节

CNGCs 是普遍存在植物体内的非选择性阳离子通道。研究发现，多个AtCNGCs 与Ca2+渗透性紧密相关。通过异源表达系统发现AtCNGC2存在CNMP依赖性K+电流，对其他单价阳离子，如Li+、Cs+和Rb+也有渗透性［25］，在维持细胞外低浓度Ca2+水平中发挥重要作用［26］。沉默番茄SlCNGC1和SlCNGC14基因导致细胞内Ca2+显著减少，表明SlCNGC1和SlCNGC14可能作为Ca2+通道发挥作用［27］。对大麦进行电生理分析，结果揭示HvCNGC2-3 通道是由Na+和K+同时存在而激活［28］。这种由2 种离子同时激活CNGC 通道的独特性质鲜见报道［21］。

CNGCs 通 道活性 受 CNMP 和 CaM 与 CNGC 可逆结合发生变构反应调节。cAMP 可激活通道引发胞内 Ca2+浓度增加，CaM 与 CNGC 相互作用调控 Ca2+浓度［29］。Zhang 等［29］运用电生理学试验发现，在非洲爪蟾卵母细胞异源表达系统中AtCNGC11/12 的活性不受CNMPs 影响，而与CaM 共表达时AtCNGC12通道活性显著增强，AtCNGC11 则无明显变化。结果表明，CaM 对CNGCs 通道活动和调节机制不同。研究表明，兰尼碱受体2（Ryanodine receptor 2，RyR2）存在不同形式CaM 的分子识别特征及调节方式。CaM 和 Ca2+-CaM 结合 RyR1 中存在 2 个有重叠的结合位点，双相调节RyR1 通道的活性［30］。植物CNGCs 存在 2 种 CaM 配体结合基序，即 CAmBD 和IQ CaM，不同的配体结合方式可能影响配体的调节功能。有研究提出，CaM 与 CNGCs 的 IQ 域 N 端结合并提供Ca2+依赖的反馈调控，从而精准地调节Ca2+信号［19］。此外，CNGCs 在不同组织和器官中可能以同源或异源聚体形式分别进行调控。Pan 等［19］研究证实CNGCs 和CaM 参与通道活动的调节和细胞中Ca2+浓度。CNGC8/CNGC7 与 CNGC18 形成的异源复合物通道与CaM2 结合，编码植物花粉管发育中Ca2+波动信号和通道活性。Tian 等［20］通过蛋白激酶BIK1 可特异磷酸化AtCNGC2 和AtCNGC4 组成的异源复合物的3 个位点，从而解除CNGCs 通道抑制状态通道，促进Ca2+内流，调控下游多个信号通路，为CNGC 的调节模式以及植物病理早期信号的感应提出了全新的作用范式。

3 植物CNGCs 生长发育功能

CNGCs广泛存在于植物细胞并参与重要的生理过程。植物CNGCs作为阳离子通道参与多个生理过程，目前已知拟南芥CNGCs的功能如图2所示［6］。

植物CNGCs 在生殖发育过程中的作用已经被广泛研究，尤其是花粉管的生长和发育。梨PbrCNGCs 表达图谱的分析显示，PbrCNGC14-18（Ⅲ亚家族）、PbrCNGC2、PbrCNGC7-9（Ⅳ-B 亚家族）和PbrCNGC12 -13（Ⅰ亚家族）在花粉中特异表达［14］。已有研究表明，AtCNGC18 只在花粉粒中表达，AtCNGC7、AtCNGC8、AtCNGC16 仅在花粉发育过程中表达［31］。其中，AtCNGC18 在花粉管中的发育过程中起主导作用。在AtCNGC18 的CNBD 结构域点突变的植株中可观察到花粉管生长发育障碍，仍可透过Ca2+，但减弱了CNMP 的激活作用。此外，AtCNGC18 在原核系统中的表达导致钙离子浓度积累，可以推测花粉管生长机制可能与Ca2+相关，将CNMP 信号转化为Ca2+流变化，说明AtCNGC18 可能是花粉管发育和顶端生长的主要Ca2+渗透通道［32］。另一个参与植物生长发育的Ca2+可渗透重要通道是AtCNGC2，参与植物开花调控、开花转型，叶片衰老和叶片细胞钙离子流入［26，33］。AtCNGC10 参与调节开花时间、叶表面扩张、下胚轴伸长、重力刺激和淀粉积累等过程［34］。在相同的温度、光照和水的条件下，抗转录AtCNGC10 的开花时间比野生型植株提前10 d，其叶片积累淀粉含量几乎是野生型植物的两倍。目前已知AtCNGC10 可以在K+缺陷型大肠杆菌、低浓度K+酵母培养基中扩增，其抗转录植株K+含量低于野生型，推测AtCNGC10 在维持细胞内的K+平衡起重要作用［34］。关于植物的发芽和根生长目前只发现可能与AtCNGC3 相关。AtCNGC3缺失突变体在高盐的环境下种子发芽数量减少，种子质量明显下降［35］。拟南芥和水稻CNGCs 可能参与生长素依赖性调节，经生长素处理的拟南芥幼苗完全丧失 Ca2+以及酸碱度敏感性［36］。AtCNGC14缺失突变体与野生型植物的根相比，根生长和重力弯曲显著延迟，根毛钙信号异常，表明AtCNGC14 在调节根毛尖极性生长的过程中是必要的［37］。

对烟草CNGCs基因通过组织特异性表达模式分析发现，23个NtabCNGCs基因在不同的组织中差异表达，表明其在植物生长和发育中是不可或缺的。其中，NtabCNGC4在种子中表达水平最高，NtabCNGC32在幼叶中表达水平最高，NtabCNGC7主要在幼花中表达，NtabCNGC11在植物茎、根和成熟叶中表达水平最高［38］。在豆类植物中也有与CNGCs 相关的发现。对蒺藜状苜蓿根中3 种可渗透钙离子的CNGCs（MtCNGC15a/b/c）在根瘤菌和菌根共生体作用的研究中发现，这些通道可形成1 个具有钾离子渗透性通道的复合物调节细胞核Ca2+的释放［39］。

4 植物CNGCs 抵御胁迫功能

植物的生理反应与外部环境紧密相关，包括抵御生物和非生物胁迫。不同的胁迫反应会导致细胞CNMP 水平信号的发生特异性变化，CNMP 作为信号分子在调节不同抗逆生理过程中发挥重要作用。CNGCs 在抵御盐胁迫过程中发挥重要作用，当土壤中高浓度盐积累会导致植物根系难以吸收和利用水分，可能会引起植株体内的K+亏缺和NaCl 积累，对植物有一定的毒害作用［5］。研究发现，当拟南芥植物暴露于高浓度的盐（NaCl）环境下，定位于根或芽中部分AtCNGCs 的转录水平增加。拟南芥幼苗中AtCNGC3 可能介导高盐环境下Na+转运，缺失AtCNGC3 的突变体会导致离子积累过少从而降低幼苗对高盐的敏感性［35］。同样的还有AtCNGC10 负调控拟南芥的耐盐性，过表达AtCNGC10 表现对高盐环境更加敏感，互补后恢复敏感性，其调节机制可能是AtCNGC10 在抵御盐胁迫时可介导Na+的转运［40］。此外，还有 AtCNGC19 和 AtCNGC20，当地上部分盐浓度提高时表达上调，推测二者可能参与盐胁迫引起的毒性效应［41］。在水稻耐盐研究中发现，耐盐性植株的OsCNGC1表达下调，说明OsCNGC1可能参与盐敏感性反应［42］。通过基因芯片表达谱分析研究还发现，千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）幼苗中AhCNGC5 和AhCNGC17 参与对盐胁迫的反应［43］。在盐胁迫下，AhCNGC5表达上调，AhCNGC17下调。这些结果与AtCNGC5 和AtCNGC17 在拟南芥中的耐盐性作用是一致［43，44］。

外环境中重金属元素的积累会破坏植物细胞膜的通透性，在抵御金属胁迫中，研究发现AtCNGC1缺失突变体可提高耐Pb2+性［45］。过表达烟草NtCBP4，增加了植物对Ni2+的耐受性和对Pb2+离子敏感。进一步的研究表明，与野生型相比，表达缺失CaMBD 和CNBD 的NtCBP4 截短体植株可提高对Pb2+的耐受性。研究鉴定并分析烟草根和叶组织在响应镉胁迫的NtabCNGCs基因表达谱，结果表明，18 个NtabCNGCs表达上调［38］。NtabCNGC6和NtabCNGC7分别在叶和根中显著表达。为研究烟草耐镉的分子机制，对其miRNA 表达谱进行分析，发现nta-miR482d 的目标基因是CNGCs。在镉胁迫下，镉敏感植株nta-miR482d 表达上调。表明miR⁃NA 在调节镉耐受反应中可能发挥了重要作用［46］。Moon 等［47］对拟南芥幼根 CNGCs 响应重金属离子的反应进行研究，结果表明，AtCNGC1、AtCNGC10、AtCNGC13 和 AtCNGC19 在 Pb2+毒性中起作用，而AtCNGC11、AtCNGC13、AtCNGC16 和 AtCNGC20 在Cd2+毒性中起作用。此外，AtCNGC1和AtCNGC13基因突变体体内Pb2+积累减少，AtCNGC11、AtCNGC15和AtCNGC19基因突变体植物中Pb2+和Cd2+积累均减少。这些发现确定了特定的CNGC基因在植物重金属胁迫响应中的功能。

干旱是降低植物吸收和利用水分、影响正常生长发育的主要因素植物。Singh 等［48］年对扁豆（Lens culinaris medikus）家族的转录组分析发现该家族的CNGCs 可能参与调节干旱胁迫耐受性，在不利环境下部分基因下调。Nawaz 等［38］通过反转录-定量聚合酶链（RT-qPCR）反应分析烟草CNGCs 发现，NtabCNGC1、3～7、14、16、17、26～28和30～33在干旱胁迫条件下基因表达水平有显著变化。多数NtabCNGCs表达从第2 天开始逐渐增加，在第8 天达到高峰。在第 8 天时NtabCNGC1、6、7、28表达水平较高。表明NtabCNGCs可能参与了干旱的后期反应。

植物对热胁迫的早期响应主要是通过调节Ca2+实现的。编码水稻16 个CNGCs，在寒冷环境下10个CNGCs 表达上调。AtCNGC6 在热应激条件下可以诱导Ca2+内流，促进热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）基因的表达。随着热胁迫的发展，cAMP 含量增加，激活AtCNGC 通道并进一步促进HSP参与热胁迫反应［49］。缺失 AtCNGC16 的突变体抑制HSP基因的表达。AtCNGC2 和 AtCNGC4 功能的紊乱使HSP表达阈值降低；小立碗藓中与AtCNGC2同源基因CNGCb，其缺失突变体表型与AtCNGC2 的缺失突变体表型相同均为对热敏感，说明其参与植物的耐热反应［50］。Katano 等［51］对AtCNGC2 和AtCNGC4 的研究进一步说明，其可能参与植物的热胁迫响应。研究发现，拟南芥AtCNGC2 2 种基因缺陷型（AtCNGC2-1 和 AtCNGC2-2）幼苗，在持续3 h 热胁迫下与野生型植物相比表现出更强的耐受性。结果证明，缺失AtCNGC2 可以增强拟南芥幼苗对热胁迫的耐受性。为探究AtCNGC2 缺失对热反应的信号通路，对各种热效应蛋白进行累积分析，试验发现AtCNGC2-1 和AtCNGC2-2 植株幼苗积累较多的热效应蛋白，而在花或叶中的热效应蛋白与野生型植物相当或低于野生型植物。Thoen等［52］研究发现，AtCNGC4 可能是响应热胁迫中超敏反应HR 信号通路中的一部分。AtCNGC4 在寒冷应激中表达下调，在热应激下表达上调。Kakar 等［15］研究发现，抱子甘蓝的CNGCs 家族有26 个基因。通过RT-qPCR 分析其在不同条件下转录水平，结果表明，BoCNGCs基因对寒胁迫敏感。26 个BoCNGCs基因中在 4 ℃孵育 24 h 后，其中 13 个BoCNGCs表达上调。其亚家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ基因表达水平与冷应激显著相关，其中BoCNGC17和BoCNGC23表达水平最高，而亚家族Ⅲ基因与对照组无明显差别或略低于对照组。枣树中ZjCNGC2和ZjCNGC4在寒胁迫下显著下调［53］。Nawaz 等［38］研究发现，10 个NtabCNGCs在冷胁迫下（4 ℃持续1、2 d）基因上调。与对照组相比，NtabCNGC6和NtabCNGC7转录水平最高。芒果参与抗寒胁迫反应中MiCNGC15Ⅱ转录水平分别在第二天、第七天和第十四天后表达上调。植物抗寒胁迫反应可能是由CNGCs 调节的钙信号引起级联反应［54］。

在抵御病原体胁迫的过程中，目前报道参与拟南芥植物病原微生物免疫反应响应的有4个基因［55］，即AtCNGC2、AtCNGC4、AtCNGC11和AtCNGC12。最新研究通过非洲爪蟾卵母细胞表达系统和双电极电压钳试验揭示了AtCNGC2、AtCNGC4在免疫响应早期应答形成的关键钙离子通道复合物及其活性调控机制［20］。当AtCNGC2或AtCNGC4单独表达时都不能形成钙离子活性通道；但当二者同时表达时，可形成钙离子活性的通道，暗示植物体内AtCNGC2和AtCNGC4可能相互作用形成钙离子通道。进一步研究发现，钙调蛋白作为门控分子与AtCNGC2-AtCNGC4通道相结合，使通道保持关闭状态；在病原体侵染时，宿主细胞通过PRRs 感知PAMPs，导致细胞内Ca2+浓度的增加，CNGC2-CNGC4-CaM 复合物被PTI信号通路上游的类受体胞质激酶BIK1 特异性磷酸化从而激活通道，介导胞外Ca2+内流，启动下游Ca2+依赖的PTI 免疫反应。这一试验进一步证实，植物CNGCs家族可能以复合体发挥作用，同时揭示了植物一种新的钙信号编码的分子机制［20］。对菜豆的研究发现，当土壤中存在立枯丝核菌时PvCNGC2转录上调，经过木霉处理后下调。推测PvCNGC2参与病原防御相关反应［56］。沉默小麦TaCNGC14和TaCNGC16基因可降低HR 反应并增加植物的抗性［17］。在向日葵（Helianthus annuus）黄萎病菌抗性植株中发现，某些CNGCs 的表达水平显著提高，这表明CNGCs 可能参与 HR 反应［57］。Kakar 等［15］研究发现，黄单胞菌病原体（Xanthomonas campestrispv. Campestris，Xcc）引起BoCNGCs 第Ⅰ、Ⅱ亚家族中 10 个BoCNGs表达上调，与植物抗寒胁迫的 CNGCs 结果一致。Zhang 等［27］用转录组学分析苹果响应杨树溃疡病（Botryosphaeria dothidea）的过程，其中与AtCNGCs第Ⅰ亚家族同源基因MdCNGC1显著上调，表明在植物对病原体的防御过程可能起负调节作用。Nawaz 等［38］在烟叶中的表达并接种黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯Y 病毒［Potato virusY（PVY）］、BSD 病毒（Phytophthoranicotianae，BSD）3 种不同的病毒，发现3 种病毒均引起NtabCNGCs表达水平显著变化。BSD 处理的植物中，19 个NtabCNGCs基因的表达上调，其中大多数基因显示较晚响应，表达水平显著升高的是NtabCNGC31。CMV病毒诱导23个NtabCNGCs显著上调，第一、第四亚家族基因转录水平波动明显，其中NtabCNGC29的表达最高。在PVY 试验中，少数第一、第四亚家族基因显著应激表达，其中NtabCNGC2响应最早，NtabCNGC33响应最晚。

5 展望

植物细胞中CNGCs 作为CNMPs 的重要受体之一，引起人们的广泛关注和研究。目前，对植物CNGC 的研究取得了一定的进展，研究的焦点主要是CNGCs基因鉴定与分组、CNGCs的结构域等。植物基因组分析显示，植物CNGCs 相较于动物是一个庞大的家族，且植物和动物的CNGCs是分开进化的，暗示植物CNGCs 的功能及分子机制可能不同于动物。随着细胞电生理技术、植物基因组测序和基因组研究方法的发展，推进了CNGCs基因的鉴定、离子通道选择性和信号转导途径中生理功能的研究，有望阐明CNGC 功能作用的分子机制。但目前关于植物CNGCs 的精准功能作用及分子机制的研究还相对滞后，为进一步的研究和证实CNGC 的功能，可以尝试进一步探索CNGCs 在不同类型植物中的亚细胞定位以及作用，如利用功能缺陷性突变体来确定CNGC 的作用及可能的分子机制。

此外，需要确定CNGC 的工作模式。动物中CNGC 以异源四聚体的形式发挥作用，推测植物CNGCs 也是通过这种机制发挥作用，比如现研究发现AtCNGC7/8 与AtCNGC18 可能会形成异源四聚体发挥作用，同时有研究表明AtCNGC7、AtCNGC8 与AtCNGC18 的表型一致且均属于第三亚家族。AtCNGC2 与AtCNGC4 可能以异源四聚体形式编码Ca2+信号波动参与植物细胞免疫反应，同时有报道AtCNGC2 和AtCNGC4 突变体具有免疫异常表型且CNGC2 与CNGC4 同属Ⅳ-B 亚家族。那么，在今后的研究中有必要探索表型一致或同一分组是否可以通过组装多聚体来发挥作用，比如AtCNGC19/20、OsCNGC12/13 等。除上述外，在植物中各类信号分子是如何动态调节CNGCs 这一分子开关，以及如何调控分子或蛋白的信息传递是今后研究的重点。