NF-κB和iNOS在ALT≥400U/L慢性乙型肝炎患者的表达及临床意义*

陈邦银 黄 津

福建医科大学附属南平第一医院感染科，福建省南平市 353000

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)仍是一类危害人类健康的慢性传染病，据统计可达上百万人次死于因HBV感染相关性疾病，尤其在我国发病率和住院率均较高，目前尚无可以彻底治愈CHB的药物[1]。肝病研究学者们对乙型肝炎(乙肝)的发病机制仍在不断的探索，至今仍有许多疑问亟待解决，认为HBV感染的发病机制与CHB患者的年龄、病毒载量、机体免疫以及传播途径等因素有关[2]。

NF-κB属于重要的转录因子，尤其是在细胞内发挥着关键作用，介导多种炎症传导途径的特异性反应，可调控机体中性粒细胞、肝细胞、内皮细胞、胆管细胞、淋巴细胞等免疫反应，发挥着较强的桥接和承上启下的功能[3]。诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)作为NF-κB下游的关键信号结合因子，参与各种炎症因子的致病过程，可介导各种免疫细胞反应，比如氧化应激、抗原抗体反应、细胞凋亡等，在病毒性肝炎中可分泌大量致炎因子一氧化氮[4]。因此，本文通过研究CHB患者外周血中NF-κB、iNOS的表达水平，了解其致炎过程，进一步发掘潜在的免疫治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入南平市第一医院感染性疾病科在2017年4月10日—2020年4月10日收治的80例CHB患者作为肝炎组，所研究对象肝功能要求谷丙转氨酶(ALT)≥400U/L，男44例，女36例，年龄19～66岁,平均年龄(47.5±11.2)岁；从我院体检中心选取60例健康人群作为对照组，男33例，女27例，年龄18～59岁，平均年龄(47.3±9.3)岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，均签署知情同意。入选标准：HBsAg阳性>6个月，且HBV DNA持续阳性，ALT≥400U/L[5]。排除标准：排除其他类型的病毒性肝炎、药物性肝炎、重型肝炎、中晚期肝硬化、肝细胞癌、自身免疫性肝病等；同时排除合并妊娠、心血管系统疾病、血液病、重症感染性疾病、内分泌系统疾病、风湿免疫性疾病、呼吸系统疾病以及恶性肿瘤等。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂：冷冻离心机(Eppendor公司，德国)；凝胶成像系统(Eppendor公司，德国)；Bandscan5.0图像分析软件(Bio-Rad公司，美国)；酶标仪(Labststems公司，芬兰)；超低温冰箱(三洋公司，日本)；Trizol裂解液(Invitrogen公司，美国)；一氧化氮ELISA试剂盒(BD公司，美国)；人NF-κB p65抗体和人iNOS抗体(Bio-Rad公司，美国)。

1.2.2 RT-PCR检测NF-κB mRNA和iNOS mRNA表达：两组标本均取外周血液6ml，分离出血浆(离心半径10cm，1 500r/min，离心5min)，将血清吸出制成细胞悬液，往细胞悬液中加Trizol裂解液200μl进行裂解，严格根据说明书步骤提取总RNA，并反转录cDNA。根据GenBank给出的序列设计引物，详见表1。

表1 NF-κB、iNOS和β-actin引物序列

1.2.3 Western Blot方法检测NF-κB和iNOS蛋白的表达：采集清晨空腹静脉血5ml，将外周血配成细胞混悬液，加入裂解液，通过高速离心获得蛋白、检测蛋白浓度，取20μg蛋白进行凝胶电泳，湿法转膜。在室温下用50g/L牛血清白蛋白封闭液进行封闭2h，洗膜后加NF-κB、iNOS、GAPDH一抗孵育，4℃封闭过夜，加入二抗孵育2h，最后曝光、显影、定影，结果用NF-κB/GAPDH、iNOS/GAPDH比值表示(Bandscan5.0软件分析)。

1.2.4 ELISA检测NO水平：严格依据NO检测试剂盒操作，绘制标准曲线，结果以各组OD值表示。

2 结果

2.1 两组NF-κB mRNA和iNOS mRNA表达水平 所有实验数据均重复3次，并计算两组相对表达量，肝炎组NF-κB mRNA和iNOS mRNA的表达水平均高于对照组，二者具有显著性差异(均P<0.01)，详见表2。

表2 两组NF-κB mRNA和iNOS mRNA表达情况

2.2 两组NF-κB和iNOS蛋白表达水平 肝炎组NF-κB和iNOS蛋白表达水平均高于对照组，二者差异有统计学意义(均P<0.05)，详见表3、图1。

表3 两组NF-κB和iNOS蛋白的表达情况

图1 NF-κB、iNOS和GAPDH蛋白表达情况

2.3 两组NO水平的比较 肝炎组的NO水平为(112.51±20.73)μmol/L，明显高于对照组的(65.18±14.54)μmol/L，差异均有统计学意义(t=18.34，P=0.001<0.05)。

3 讨论

大多数HBV感染者可以通过机体较强的免疫反应将病毒完全清除，仍有部分HBV感染者因免疫功能紊乱，最终演变成慢性HBV病毒感染，如果不注意诱因的控制，随时有可能激发乙肝病毒复制[5]。研究表明[6]，慢性乙型肝炎具有一定个体差异，每个感染者的免疫状态、病毒活跃指数、肝细胞的炎症程度都不完全一致，在机体免疫应答具有一定调控作用。本研究通过以慢性乙型肝炎患者作为研究对象，通过基因检测和蛋白检测手段分析NF-κB、iNOS、NO在乙肝患者中的表达，发现肝炎患者的上述指标明显高于健康对照组人群，提示NF-κB、iNOS、NO等炎症因子可能参与慢性乙型肝炎的发生发展过程，有望通过干预NF-κB、iNOS、NO等细胞因子控制炎症反应。

NF-κB经过很多学者证实，属于一种重要细胞核内的转录因子，参与多种细胞的炎症信号传导通路，由于其具有多向性调节功能，起着关键的桥接作用[7]。NF-κB对体液免疫和细胞免疫亦具有显著作用，可以通过调节B细胞Ig基因的表达，同时T细胞的增殖活化也很关键，可促使下游iNOS增多，分泌大量的一氧化氮，可造成细胞和组织损伤[8]。王翔鹏等[9]学者通过建立小鼠肝损伤模型，采用刀豆蛋白A干预肝损伤模型，发现随着刺激诱导时间的延长，NF-κB转入核内水平持续上升，小鼠肝组织内生成超过生理剂量并具有细胞毒性的NO，加重肝组织免疫损伤。还有研究报道[10]，通过建立免疫性损伤小鼠模型，使用NF-κB抑制剂后可下调iNOS的表达，减少NO的分泌，最终减轻小鼠免疫性肝损伤，由此认为NF-κB调控iNOS、NO可能是出现肝脏免疫性损伤的关键环节之一。本研究发现二者在肝炎组表达水平增高，与对照组相比差异尤为明显(P值<0.05)，随之分泌的NO水平亦明显升高，由此推想NF-κB、iNOS、NO可能在肝脏疾病的炎症中起重要作用。

综上所述，慢性乙型肝炎实质上亦属于一种免疫性疾病，认为导致肝细胞损伤的主要原因是HBV感染后激发机体的细胞免疫反应，我们通过临床与基础的研究，发现可能存在NF-κB-iNOS-NO这样一条信号通路，可能参与慢性乙肝的炎症反应过程，期望未来通过该通路挖掘出新的治疗靶点。