角膜缘保护技术在经上皮角膜交联术中的应用效果

王萌萌，王晶晶，刘延东，李明然，尹会苏，张印博，董兴国

0引言

角膜交联(corneal collagen cross-linking，CXL)是一类提高角膜生物力学强度和对抗生物降解能力的新型技术，目前专指已经在眼科临床上应用的紫外光-核黄素(riboflavin)角膜交联手术技术。CXL采用370nm的紫外光A照射被核黄素浸润的角膜，可以使角膜纤维之间发生共价键结合，提高了胶原纤维的生物力学强度和生物学稳定性，主要用于治疗圆锥角膜、大泡性角膜病变、角膜炎等疾病[1]。大量研究已经表明，CXL能够有效阻止圆锥角膜的进展，是目前圆锥角膜综合治疗措施中的重要组成部分。CXL的主流术式有两种，即经典的去上皮角膜交联(epithelium-off CXL，Epi-off CXL)和经上皮角膜交联(epithelium-on CXL，Epi-on CXL)。Epi-off CXL又被称为Dresden方案，是最早提出的经典角膜交联方案，由于角膜上皮层的细胞间紧密连接阻碍了光敏剂核黄素渗透进入角膜基质层，需要术中人为去除角膜上皮层，因此不可避免地带来了术后疼痛和角膜上皮愈合问题；Epi-on CXL又被称为跨上皮角膜交联(transepithelial corneal collagen cross-linking，TECXL)，是采用化学和电渗等方法促进核黄素进入角膜基质层，由于术中不用去除角膜上皮，所以术后不适感较轻，视力恢复也较快。其中化学法是在核黄素溶液中加入苯扎氯铵或乙二胺四乙酸(EDTA)等化学促渗剂。这些化学促渗剂能够引起角膜上皮细胞间的紧密连接发生断裂，导致角膜上皮疏松，便于核黄素的渗透。与电渗法相比，化学法不需要特殊仪器，所以在国内外应用较多[2]。

尽管CXL对圆锥角膜具有明显的防治作用，但是该手术的安全风险依然不能被忽视，尤其是紫外光A[3]和化学促渗剂[4]都具有一定的组织毒性，CXL本身也会引起治疗部位组织细胞的死亡[5]。基础研究已经发现CXL手术可造成角膜缘干细胞的损伤，并建议在术中对角膜缘进行必要的保护[6]，然而目前国内外尚未见有关角膜缘保护的临床研究报道。我院自2015年开展CXL手术以来，一直重视术中对角膜缘的保护。本研究将对治疗圆锥角膜的Epi-on CXL术中使用的一种角膜缘保护技术的临床应用效果进行评估。

1对象和方法

1.1对象本研究为前瞻性临床研究。选取2019-01/12河北省眼科医院收治拟行Epi-on CXL手术的双眼进展期圆锥角膜患者15例30眼，其中男8例，女7例，平均年龄20.2±1.8岁。右眼15眼纳入试验组，Epi-on CXL术中采用角膜缘保护技术；左眼15眼纳入对照组，Epi-on CXL术中不采用角膜缘保护技术。纳入标准：(1)年龄大于18周岁；(2)明确诊断为双眼进展期圆锥角膜；(3)中央角膜厚度大于400μm；(4)双眼行Epi-on CXL手术。排除标准：(1)伴有其它眼部合并症；(2)患有全身系统性疾病；(3)有眼部感染史；(4)有眼部手术史；(5)有眼部外伤史；(6)有软性或硬性角膜接触镜配戴史。本研究经过河北省眼科医院医学伦理委员会的许可实施，手术前每位患者及其家属均充分理解该研究的意义和手术风险，并自愿签署科研和手术知情同意书。

1.2方法

1.2.1手术方法所有患者术前3d均采用5g/L左氧氟沙星滴眼液点眼，每天4次。Epi-on CXL手术均由同一名手术医师(第一作者)采用KXL紫外光交联系统完成。眼部消毒、铺巾、开睑，表面麻醉。试验组首先在角膜缘和球结膜表面注射薄薄的一层医用透明质酸钠凝胶，在角膜表面居中放置已灭菌的自制不锈钢金属环(内径9.0mm，外径13.0mm，厚2.0mm)，用蘸有生理盐水的海绵将金属环中央孔内露出的角膜表面擦拭干净后滴加0.25%核黄素透上皮配方溶液(含乙二胺四乙酸、碱式氯化铝等化学促渗剂)至覆盖住裸露的角膜表面，注意不要让核黄素溶液从角膜和金属环表面流下来(图1)。浸泡角膜240s后生理盐水冲洗并蘸干角膜，滴加0.25%核黄素盐溶液(不含化学促渗剂)浸泡360s，再次生理盐水冲洗并蘸干角膜。采用370±5nm紫外光A照射角膜表面160s，光斑直径9mm，照度45mW/cm2，能量密度7.2J/cm2，照射过程中适时滴加生理盐水以保持角膜表面湿润。试验组角膜表面的金属环自手术开始时放置，直至紫外光照射结束取下。对照组不放置金属环，直接在角膜表面滴加0.25%核黄素透上皮配方溶液使之覆盖住全部角膜表面，将流淌进入结膜囊内多余的0.25%核黄素透上皮配方溶液用棉签擦除，其余用药和紫外光照射步骤同试验组。两组术后均采用5g/L左氧氟沙星滴眼液点眼，4次/天，共14d；1g/L玻璃酸钠滴眼液点眼，4次/天，共14d；1g/L氟米龙滴眼液点眼，4次/天，共7d，每周递减1次，持续4wk。

图1 在Epi-on CXL手术中采用的角膜缘保护技术 术中治疗区域外的眼球表面涂抹医用透明质酸钠凝胶，并在角膜上放置自制的不锈钢金属环，该技术能够防止含有化学促渗剂的核黄素溶液渗漏到非治疗区域的角结膜表面，并能遮挡角膜缘以避免紫外光的辐射损伤。

1.2.2随访观察随访并记录术前、术后7d，3mo时两组最佳矫正远视力、散光度、角膜曲率Sim-K平均值(Km) 、角膜最薄点厚度、泪膜破裂时间，其中Km、角膜最薄点厚度、泪膜破裂时间均采用Sirius眼前节分析系统检测获得。术后7d时，采用患者主观评分法评估术后不适感，总分0～9分，0分为无不适，9分为非常痛苦。随访期间，观察并记录两组角膜上皮愈合时间。

统计学分析：采用IBM SPSS Statistics 23统计软件包进行数据分析。计量资料的统计描述采用均数±标准差表示，采用重复测量设计的广义估计方程比较手术前后两组最佳矫正远视力、散光度、Km、角膜最薄点厚度、泪膜破裂时间的差异；采用配对样本t检验比较两组术后不适感和术后角膜上皮愈合时间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

手术前后不同时间点两组最佳矫正远视力、散光度、角膜最薄点厚度、泪膜破裂时间比较，均具有时间差异性(χ2=17.010、6.500、829.489、52.230，P<0.001、=0.039、<0.001、<0.001)。其中，术后3mo时的最佳矫正远视力优于术前和术后7d，差异均有统计学意义(P<0.05)；术后3mo时的散光度小于术前，差异有统计学意义(P=0.043)；与术前相比，术后7d，3mo时角膜最薄点厚度差异均有统计学意义(P<0.001)；与术前相比，术后7d时泪膜破裂时间变短，随后尽管有所恢复，但依然小于术前，差异均有统计学意义(P<0.001)，见表1、2。两组手术前后不同时间点Km无时间差异性(χ2=0.437，P=0.804)。此外，手术前后不同时间点两组最佳矫正远视力、散光度、Km、角膜最薄点厚度、泪膜破裂时间比较，均无组间差异性(χ2=0.515、0.112、1.227、0.041、0.416，P=0.473、0.738、0.268、0.839、0.519)，时间与组间也无交互作用(χ2=2.134、0.277、2.687、3.973、0.572，P=0.344、0.870、0.261、0.137、0.751)。

表1 手术前后各观察指标检测结果

表2 广义估计方程中各观察指标时间差异分析结果

试验组和对照组术后不适感评分分别为3.13±0.99、3.33±1.23分，差异无统计学意义(t=0.764，P=0.458)。试验组术后角膜上皮愈合时间(3.20±0.56d)比对照组(3.73±0.96d)短，差异有统计学意义(t=2.256，P=0.041)。

3讨论

角膜缘是保障角膜上皮细胞动态平衡的重要部位，对维持角膜透明性和眼表完整性起到了重要作用[7]。其中，角膜缘Vogt栅栏结构区被认为是角膜缘干细胞之所在。各种原因导致的角膜缘干细胞受损和缺乏会引起角膜和眼表功能障碍[8]。尽管大量临床研究已经证实CXL手术在防治圆锥角膜方面的有效性和安全性[9]，但是依然不能忽视CXL手术可能引起的角膜缘损伤。基础研究发现，CXL具有细胞毒性作用，不仅能够降低角膜缘部位上皮细胞的扩增能力[10]，而且会引起细胞凋亡[11]。临床研究也有关于CXL术后发生角膜缘干细胞失代偿[12]、角膜上皮延迟愈合[13]、诱发眼表肿瘤[14-15]等个别病例的报道，提示CXL术中保护角膜缘的重要性。

与以往研究[1-2]结果相似，本研究中，无论是否采用角膜缘保护技术，患者术后3mo时最佳矫正远视力、散光度均优于术前(P<0.05)；两组术后角膜最薄点厚度均逐渐减小(P<0.05)；两种Epi-on CXL手术均造成术后短期(7d)泪膜破裂时间缩短，尽管在术后中期(3mo)时有所恢复，但依然低于术前水平(P<0.05)。本研究试验组所采用角膜缘保护技术未对Epi-on CXL手术患者的最佳矫正远视力、散光度、Km、角膜最薄点厚度、泪膜破裂时间、术后不适感方面造成显著影响，说明此种角膜缘保护技术并不能提升Epi-on CXL手术治疗圆锥角膜的临床疗效。然而，本研究结果显示此种角膜缘保护技术能够缩短术后角膜上皮愈合时间，提示该技术可能在降低Epi-on CXL手术源性损伤、保护角膜缘组织、维护角膜上皮修复能力方面具有重要的保护作用，并能够提高Epi-on CXL手术的安全性。

目前国外研究者已经开发和报道了几种CXL术中角膜缘保护技术。相比而言，本研究所采用的角膜缘保护技术具有操作简单、效果确切、成本低廉、器材可重复使用等诸多优点。Lee等[16]通过动物实验验证CXL术中采用一种直径为9mm的金属挡圈(retention ring)限制核黄素溶液扩散到角膜缘，从而使角膜缘干细胞免于受到CXL的损伤。需要强调的是，上述动物实验研究中使用的金属挡圈需要术者手持并施压于眼球，其保护角膜缘的原理只是阻止核黄素溶液对角膜缘浸润，并没有在术中对紫外光进行遮挡，因此无法避免术中紫外光辐射性损伤；使用金属挡圈的动物眼角膜发生了较为严重的炎症反应，作者推测可能与核黄素潴留引起过度的交联反应有关，也可能是由于金属挡圈对角膜的压迫引起的。本研究使用的自制不锈钢金属环无需手持，其与角膜表面的贴敷是依靠金属环的自身重量和眼球表面医用透明质酸钠凝胶的黏附作用。术中该金属环能够阻止核黄素溶液渗漏到角膜缘和结膜囊；由于该金属环具有一定的宽度，所以能够托起足够的核黄素溶液覆盖住裸露的角膜表面；该金属环的宽度能够遮挡角膜缘，从而保护角膜缘免受紫外线的直接照射。本研究未发现试验组出现Lee等[16]在其动物实验中发生的比对照组更为严重的炎症反应，我们推测由于本研究所使用的金属环不需要手持和施压，因而可能对眼部的刺激性较小。

Jeyalatha等[17]在离体人眼实验中使用了一种聚甲基丙烯酸甲酯制成的透明遮挡环，发现该遮挡环能够保护角膜缘干细胞免受CXL术中紫外线的辐射损伤。Bilgihan等[18]采用角膜接触镜中央打孔的方法制作了一种简易的角膜缘遮挡环，并使用激光照度计检测证实了该中央打孔的角膜接触镜能够有效阻断紫外线的穿透，但是没有在其研究中提及该方法的临床应用效果。与以上两种术中角膜缘保护技术相比，本研究使用的保护技术具有以下可能的优势：本研究使用的金属环不仅遮光更彻底，而且具有一定的重量，能够稳定地放置在角膜上，不容易受到眼球不自主运动的影响而发生移动；除了金属环自身重量的作用之外，医用透明质酸钠凝胶能够更好地封闭金属环与角膜之间的间隙，有效防止核黄素溶液渗漏到角膜缘，进而可以避免核黄素溶液中化学促渗剂对角膜缘的毒性损伤，因此尤其适合在Epi-on CXL手术中使用。此外，已有研究证实透明质酸钠本身也能够降低化学渗透剂EDTA对人角膜上皮细胞造成的氧化损伤[19]。因此，本研究中使用的角膜缘保护技术比以往研究中提及的金属挡圈技术、聚甲基丙烯酸甲酯环技术和中央打孔的角膜接触镜技术等更具临床推广价值。

本研究的主要不足之处在于病例数较少、随访时间较短，因此除了术后角膜上皮愈合时间外，未发现试验组和对照组更多的差异。然而，由于CXL手术是一项较为安全的手术技术，其本身发生角膜缘干细胞损伤相关的临床病例较少，所以术中角膜缘保护技术的重要作用可能很难在临床研究中显现出来。此外，本研究仅对该角膜缘保护技术的临床疗效进行了分析，未开展在角膜缘细胞活性、细胞形态、核黄素浸染程度等方面的基础性研究来加以佐证。今后我们将继续深入研究，不仅努力收集和纳入更多的病例、延长随访时间，并且对以上几种术中角膜缘保护技术进行深入比较，以期望为广大手术医师提供更多的临床应用参考。

总之，本研究中所采用的术中角膜缘保护技术能够缩短Epi-on CXL术后角膜上皮愈合时间，初步证实了该术中角膜缘保护技术在Epi-on CXL手术中应用的可行性和安全性，其长期的临床应用价值有待今后进一步研究加以验证。