TLRs信号通路在干眼发病机制中的研究进展

李宝花，宁博彪，魏宇娇，唐雪凤，葛惠玲，马芬俞

0引言

国际干眼共识(TFOS DEWS Ⅱ)的定义和分类小组重新定义了干眼的概念：干眼(dry eye disease，DED)是眼表的一种多因子疾病，特征是泪膜稳态的丧失并伴有眼表症状，其病因包括泪膜不稳定、泪液高渗性、眼表炎症与损伤和神经感觉异常[1]。DED主要临床表现为眼睛异物感、干涩感、烧灼感、畏光、视物模糊和视疲劳。DED所造成的社会经济负担和对个人视力、生活质量和生产力产生的不利影响以及疼痛对身体和心理的影响都是值得思考的。明确干眼的发病机制，对于干眼的防治显得尤为重要。越来越多的研究表明，炎症在干眼发病机制中起着至关重要的作用，因此干眼的炎症机制及抗炎治疗已成为近年研究的热点。相关研究显示Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)及其信号系统表达的调控在干眼的炎症反应过程中发挥了重要作用[2-3]。本文总结近10a来有关TLRs对干眼免疫应答的研究，探讨通过对TLRs信号通路的调节及控制以达到对干眼的治疗及预防。

1 Toll样受体及其信号转导通路

Toll样受体是先天免疫系统的模式识别受体，可识别高度保守的微生物结构和产物[4]。目前，15种TLRs已被人类发现，TLR1～TLR9为人鼠所共有，TLR10只存在于人类，TLR11、TLR12及TLR13只存在于鼠类，TLR14以及TLR15已经在鼠与鸡内有所发现，也有人认为TLR14为人、鼠共有[5]。

1.1 TLRs的组织结构TLRs家族是一个高度重合的同源家族，其基本的结构组成包括3个部分，分别为：胞外区、跨膜区和胞内区。十余个含有亮氨酸的碱基重复序列相连接而构成胞外段，MD-1、MD-2和RP105是其重要的辅助蛋白，胞外段的主要作用就是识别与其相应的配体，来传递其所需要传递的信息。胞内段的主要亮点在于髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，MyD88是一种用来转换以及传达信号的蛋白，参与着TLRs的信号传递，以完成整个信号通路的信息传导[6]。

1.2 TLRs的微生物配体正如上面所提到的，胞外段的主要作用就是识别与其相应的配体，故而因其TLRs的不同，与其相应的配体也分别各有差异。TLR1，2，4，5，6和10的识别受体通常显示在细胞表面上，与其相应的配体相结合；而TLR3，7，8和9通常位于细胞内的内体膜上，因为它们的天然配体可能仅存在于细胞的酸性区室中[7]。特定的TLRs结合相应的特意性配体，如：TLR3识别病毒的双链dsRNA；TLR5识别细菌鞭毛蛋白；TLR6主要与TLR2协同作用识别细菌的PGN和脂肽；TLR7和TLR8对病毒性单链RNA起反应；TLR9可介导对细菌CpGDNA的胞内反应。

1.3 TLRs信号转导通路每一个TLRs家族成员必须依赖于Toll样受体特定的组成结构向相应的细胞转导表达的信息，与其特有的转接蛋白相接触，核转录因子NF-κB、丝裂原蛋白激酶(MAPK)p38、IFN诱导因子等被激活、传递信息，操纵的特定基因激活并表达。MyD88、MyD88-转接体样/TIR-相关蛋白(MAL/TIRAP)、Toll受体相关分子(TRAM)、诱导IFN-β的含TIR结构域转接体(TRIF)和SARM，这5种转接蛋白，参与着TLR信号转导通路的表达。其中，MyD88和TIR结构域转接体能够激活下游酶，其特有的酶链反应激活信号通路的表达，而Toll受体相关分子和MyD88-转接体样/TIR-相关蛋白，其作用机制是转运髓样分化因子88以及TIR结构域转接体，同样诱导TLRs信号转导通路，接头蛋白SARM则与TLRs信号通路的负调节有关。

上面所说的特异性接头蛋白，将TLRs信号转导通路的转导途径分为MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径，也是其最根本的转导方式[8]。MyD88依赖性途径是大多数的信号转导途径。其中某些Toll样受体胞外段识别与其相应的配体结合以后，直接作用于髓样分化因子88，比如TLR5、TLR7、TLR8和TLR9；而TLR4、2不能直接作用于髓样分化因子88，中间要先形成二聚体、结合桥梁接头蛋白Mal，才可以发挥转接作用。整个途径所活化及磷酸化的因子及化合物有TAK1、IKK复合物及IkB，IkB降解以后，NF-κB才能转位至细胞核，诱导肿瘤坏死因子-α活化，完成炎症反应的整个过程。髓样分化因子88的非依赖途径很少被利用，只有TLR3、专门修饰后的TLR4以及TLR5所利用，诱导肿瘤坏死因子-β活化，同样诱导炎症反应的最终表达[9]。

以TLR4为例，TLR4不但能激活髓样分化因子88依赖途径，而且还能激活髓样分化因子88的非依赖途径。MyD88依赖途径：TLR4与特异性配体相结合以后，与桥梁接头蛋白Mal相结合以后，与髓样分化因子88的一端相结合，而另一端与白介素受体酶1和2相结合，并使其磷酸化，然后激活TNF6，活化TAK1，IkB磷酸化并降解，活化髓样分化因子88，转位在细胞内，诱导白介素1、6、8等炎症因子的免疫应答反应，从而使炎症发生[10-11]。MyD88非依赖性信号转导途径：髓样分化因子88不被激活，主要是通过激活β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing inter feron-β，TRIF)完成的，其过程也是活化NF-κB活化因子以及其它炎症因子，而激发炎症反应[12-13]。

2 TLRs及其信号通路在干眼中的表达

干眼是以泪膜稳定性失常为主要特点，伴有眼部干涩感、异物感、眼红、酸涩感等症状的眼表炎症疾病，近些年的研究将干眼的作用机制主要关注于：泪膜稳态失常、泪液高渗透性以及局部炎症反应[14]。随着环境污染加剧、电子产品的大规模运用以及社会压力的不断增加而导致不良的生活作息及饮食失宜的不断加剧，使干眼发病的脚步进一步加快。发病率不断升高的干眼危及着越来越多的人类生活，轻者影响生活质量，重者导致患者角膜上皮的缺损、角膜发生新生血管、角膜翼障、角膜的损伤、视力下降甚至失明。

干眼的发病因素复杂，炎症作为干眼不可推卸的责任，有待我们进一步思考，眼表的高渗透性与炎症反应不断地刺激眼表的稳态，炎症的不断刺激，眼表的神经末梢受损，对外界的刺激越来越不敏感，进而瞬目减少，加重干眼患者的眼表不适感进一步加重，成为恶性循环，寻求其最根本的作用机制已经成为大势所趋，相应的抗炎治疗引起越来越多的热议[15-17]。目前众多实验已经证明与眼表炎症相关的因子有很多[18-24]，比如白细胞介素：IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-1β，肿瘤坏死因子：TNF-α、TNF-β，Toll样受体：TLR2、4、9，核转录因子-κB(NF-κB)等。

干眼患者眼表的免疫调节机制紊乱，众多研究已经表明，TLRs及其信号系统的表达在干眼的炎症反应过程中发挥了重要作用，其信号通路的高度表达，诱发并加重其炎症的表达[25]。所以，与之相关的研究应当重视其通路的作用机制，探究其与干眼的高度相关性，为干眼的诊断及治疗寻找更有效且长久的理论依据。

2.1 TLRs在干眼相关组织中的表达干眼所参与的功能单位主要涉及到泪膜、角膜、结膜、泪器(主要是泪腺)、睑板腺等。这些组织对于保证泪液的正常分泌，以及维持眼表的正常润泽，保证正常的视物功能，有着重要的作用。其中任一组分的损害均可导致泪膜稳态的丧失，而泪膜的持续异常可进一步引起上述功能单位中其他组分的病理改变，进而导致干眼的发生[26-29]。综上所述，各种原因导致的角膜上皮的缺损，角膜的新生血管、角膜翼障、角膜的损伤以及角膜瘢痕等不仅可以导致干眼，也可以互为因果、相互加重。

2.1.1 TLRs在角膜中的表达Rachel等已经证明Toll样受体在干眼中高度表达，给予高渗透环境，检测角膜上皮细胞中的TLR4、TLR9均有所表达，而TLR5 mRNA则无表达，TLR4增加8.18倍，TLR9减少0.58倍；给予干燥环境，发现TLR4和TLR5 mRNA均上调、TLR9 mRNA则下调，其相应的表达分别为4.81、2.51、0.86倍[30]。Lee等[4]研究结果表明干眼的炎症由TLR4信号通路所诱导，其水平与干眼的严重程度呈现正相关。Chinnery等[31]研究了上皮清创术后小鼠TLR9配体诱导的角膜炎症的机制，结果数据显示局部应用CpG寡脱氧核苷酸(ODNs)，可以使TLR9活化而诱导眼内炎症，ODNs除可以诱导干眼以外，还可诱导其它炎症。Li等[3]研究显示，TLR4存在于正常人的角膜内，当炎症增加时，其水平随着干眼的程度升高。周芳等[32]研究大鼠角膜碱烧伤早期炎症反应的动物实验中，结果显示TLR2、TLR4不仅参与了角膜碱烧伤的炎症反应，而且还诱导并促进其加重。以上数据均表明角膜中表达Toll样受体，而且在炎症来临时Toll样受体发挥出至关重要的作用。

2.1.2 TLRs在结膜和泪腺中的表达Micera等[33]已经证实了TLR4、TLR9参与了春季角膜结膜炎的发生，导致结膜上皮中TLR4转录调节和TLR9转录下调。Reins等[34]证实干眼眼表结膜中TLR2、4、9表达，以及泪腺中TLR5表达均有不同程度的增加。Barabino等[2]研究显示干眼患者的眼表损害伴着TLR9表达的上调，进一步证明TLR信号通路参与着干眼的眼表炎症。Rachel等研究干眼炎症中TLRs和抗微生物肽(AMP)的表达[35]。结果实验性干眼上调睑结膜中的TLR2、3、4和9 mRNA表达，并且发现在角膜上皮中也发生了TLR2、3和9 mRNA的表达，同时发现泪腺中TLR2、TLR5有所上调，总体而言，TLRs蛋白有相应的变化。杨青霞等[36]探讨五羟色胺在摄取抑制剂引起干眼的潜在机制的实验中，证明氟西汀可激活结膜上皮细胞中TLR2/NF-κB信号通路，进而抑制了干眼的眼表炎症。

2.2 TLRs在干燥综合征中的表达干燥综合征(Sjögren’s syndrome，SS)是一种慢性炎症性自身免疫病。干燥综合征其中最重要的临床表现就是眼干、口干。Marie等以20例原发性干燥综合征患者和20例健康对照者做实验，并检测外周血中TLR1-10蛋白及mRNA水平，结果发现SS患者TLR8 mRNA水平显著高于对照组，而TLR9 mRNA水平显著低于对照组，TLR5显著减少，TLR7显著增加[37]。Ainola等[38]用凋亡细胞培养基连续离心步骤收集的凋亡颗粒，对SS自身抗原在这些颗粒中的表达和定位进行了分析，结果表明雄激素保护细胞免受细胞凋亡，影响自身抗原的重新分布，并减少细胞凋亡刺激颗粒的增加。Nakamura等[39]研究了Toll样受体等先天性免疫细胞，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及TLR9参与诱导了SS患者的炎症，TLR3还可以诱导SS患者唾液腺上皮细胞凋亡，从而导致干燥综合征的产生。由此我们可以猜想这些信号通路对泪腺是不是也有相似的作用。

这些数据初步表明，干眼的发病机制之中，TLRs差异性参与表达，并提示TLRs参与干燥综合征的炎症反应，不论是SS型干眼还是非SS型干眼，其炎症机制均与TLRs信号通路有密切的关系。目前尚不完全清楚其具体的机制及其结果。然而，无论病因如何，表达模式何如，更详细的作用机制必将是研究的重点。

3不同干预方法对干眼TLRs通路的影响

3.1中药对干眼TLRs通路的影响中医以整体观念为指导，注重辨证论治，强调调整恢复人体的整体阴阳平衡，众多研究证明，中药可以通过清热解毒、滋阴、活血化淤等作用调节炎症反应[40-42]。林崇泽等[43]观察益气养阴祛瘀中药对干燥综合征的影响，结果发现益气养阴祛瘀中药下调了血清TLR9表达，并且有效地缓解了眼睛干燥症状。黄绥心[44]观察益气养阴祛瘀方干预肥胖糖尿病自发性干燥综合征的作用，结果表明TLR-IFN-BAFF信号通路参与了肥胖糖尿病自发性干燥综合征的发生，并且益气养阴祛瘀方下调TLR5、IFN-α、BAFF mRNA及蛋白的表达，并且有效地解决了小鼠的口干等症状。韦尼[45]通过观察活血解毒方的作用机制，结果发现活血解毒方有效地增加了小鼠(NOD)的唾液分泌量，同时降低NOD小鼠血清TLR2、TLR4、CD14蛋白表达及颌下腺TLR2、TLR4、CD14 mRNA水平。孙会兰[46]在研究逍生散颗粒剂对干眼小鼠模型角结膜组织TLR4及NF-κB影响的实验中，实验结果表明逍生散颗粒剂对小鼠干眼模型角结膜组织TLR4、NF-κB两条通路均有抑制作用，进而加快干眼的症状缓解。

3.2针灸对干眼TLRs通路的影响上面谈到中医的治疗优势，而针灸可以改善病变局部的血液循环,疏通经络，且副作用少、依赖性小、安全性高,是一种广泛为大众接受的绿色疗法。毫针透刺法中的多种补泻手法同样可以实现所谓“消炎”之功[47]。张丹[48]观察电针治疗干眼的临床疗效，结果发现电针对TLRs/NF-κB信号通路有影响，并且很大程度缓解了干眼患者的症状，提高了生活质量。

3.3其它一些中成药、西药、靶向药等药物的抗炎机制也是不可忽略的。Putranto等开发了RAGE肽抑制剂，在聚乙烯亚胺阳离子的作用下，传递于细胞内，该肽与TLR-IL-1受体域结构衔接蛋白相结合，进一步阻断了眼表炎症的发生[49]。付荣嵘[50]的研究表明瑞巴派特对小鼠的结膜及泪腺中炎症具有抑制作用，其作用机制为抑制TLR4、MyD88、NF-κB的表达,从而阻止其炎症反应。

4结论与展望

近年来有关干眼的治疗方法层出不穷，不可否认的已经收到很多突破性的研究，但就其发病率高及其现有的治疗方法并未将其完全治愈引来越来越多的临床工作者热议，近年来干眼的炎症机制及抗炎治疗已成为研究的热点，众多的研究已经证明，TLRs信号转导途径是干眼炎症发生的重要机制，及其信号通路的调控在干眼的炎症反应过程中发挥了重要作用。干眼的发生主要依赖于Toll样受体上特异性接头蛋白，将TLRs信号转导通路的转导途径分为MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径。

目前认为炎症是干眼发病的核心。TLRs在介导干眼的免疫应答、诱导多种炎性因子生成、启动获得性免疫应答中发挥重要的作用。TLRs在干眼相关组织角膜、结膜、泪腺、睑板腺中均有表达，TLRs在干燥综合征外分泌腺、唾液腺有相应的表达，故TLRs参与非SS和SS干眼的病理生理学。通过调控TLR信号通路治疗干眼可能是中药、针灸、瑞巴派特及RAGE肽抑制剂等治疗方法的作用机制之一。

然而，目前的研究对于TLRs及其信号系统的了解还不够深入，除去目前已经发现的15种TLRs外，是否还有更多的TLRs未被人类所知道；除去所发现的MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径以外，是否还有其它的TLRs信号通路的表达途径也是现有的技术未知的；TLRs家族成员之间有没有必然的联系，联系的机制是怎样的并未充分证明；药物通过该信号通路作用于干眼的整个途径中，从上游到下游所参与的所有因子的表达也不够详尽。此外，中医药运用于干眼的临床使用的方式也十分局限，目前的相关研究中多以中药汤剂为主，虽然取得了一定程度上的疗效，但缺乏其他有效手段如针灸、拔罐、按摩等的相关研究，导致中医药对于干眼的预防、治疗等方面整体辨证、治病求本的优势还远未发挥出来。这些问题亟需大量的研究来证明、解决。