等温扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展

董晶，卢鑫，郭威，杨倩，张伟,,3*

1(河北农业大学 食品科技学院，河北 保定，071001)2(河北农业大学 理工学院，河北 沧州，061100) 3(河北农业大学 生命科学学院，河北 保定，071001)

食源性致病菌的检测是预防与控制食源性疾病的关键步骤之一。传统培养方法公认度高，稳定性好，但检测周期较长，耗时费力[1]。因此加强对食源性病原菌的快速检测与筛查对保障食品安全至关重要。随着分子生物学技术的不断发展，核酸检测技术成为近年来研究热点之一，最早开发的PCR技术及其拓展技术在食源性致病菌的检测与鉴定中发挥着重要的作用，但该技术需经历反复的升降温过程，对设备要求高。随后等温扩增技术逐渐发展起来，在恒定温度下即可反应，摆脱了对精密温度循环设备的依赖。

目前常用的等温扩增技术包括环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、链替代等温扩增(strand displacement amplification，SDA)、单引物等温扩增(single primer isothermal amplification，SPIA)、滚环等温扩增(rolling circle amplification，RCA)以及河北农业大学生物检测技术创新团队自主开发的跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification，SRCA)等。

核酸等温扩增技术依据检测目标不同可分为“目标放大”和“信号放大”两类，LAMP、SDA、SPIA以及SRCA均属于目标放大扩增技术；RCA则归类于信号放大技术。以扩增对象的不同可分为“DNA扩增”和“RNA扩增”两大类，上述5种等温扩增方法均属于DNA扩增。本文综合国内外相关报道，对上述5种技术的研究进展以及存在的共性问题进行简要概述，并提出改进措施，为食源性致病菌的快速检测与筛查以及食源性疾病的预防与控制提供了参考依据。

1 环介导等温扩增技术

LAMP最早由日本学者NOTOMI等[2]开发。该方法依靠具有强链置换活性的BstDNA聚合酶和4～6条特异性引物在60～65 ℃恒定温度下进行扩增，对设备要求低，基于LAMP技术的一些拓展技术已成功应用于食源性致病菌的检测[3]。相兴伟等[4]利用双重LAMP法同时检测海产品中的霍乱弧菌和副溶血性弧菌，检出限均为50 CFU/mL；还可通过观察产物浊度判定结果，提高检测效率。CHUN等[5]将LAMP方法和回射Janus粒子(retroreflective Janus particle,RJP)相结合开发了一种基于LAMP技术的传感器方法用于检测沙门氏菌，通过RJP的数目定量分析LAMP产物的浓度，检测限达到了102CFU/mL。

LAMP方法具有极高的特异性，不易受非靶基因的影响，若向体系中加入环引物，反应时间可缩短一半[6]。但用凝胶电泳法观察扩增产物时较为模糊，且易受气溶胶污染[7-8]。LAMP反应引物数量多，引物间易相互作用，影响扩增结果的准确性，且LAMP产物结果分析仅能判断是否扩增，无法对产物的来源以及产物的特异性进行分析。

2 链置换等温扩增技术

SDA技术于1992年由WALKER等[9]开发。该技术的核心是利用限制性内切酶识别并切割DNA链上的特定位点，打开缺口，被切割下来DNA链的3′端在聚合酶的作用下不断延伸，并将下游序列置换下来，在等温条件下成几何倍数级联扩增。有研究表明SDA-DNA传感器技术与qPCR方法及常规方法相比更加快速、准确[10]。WU等[11]将SDA与免疫层析结合用于检测食品中的大肠杆菌O157：H7，检测限为10 CFU/mL，仅捕获在细胞膜上的适体，降低假阳性结果发生的概率，且无需进行DNA提取，操作更加简便、快捷。邓世琼等[12]利用缺口酶Nt.BstNBI替代限制性内切酶用于SDA反应，不仅解决了传统链置换技术中要使用修饰底物的问题，还大大降低了成本，对于质粒检测的灵敏度低至2 pmol/L。

随着对SDA技术研究的不断深入，该技术也暴露出一些不足之处，SDA反应体系中的dNTP大多需进行加工修饰，且靶序列的长度一般不超过200 bp；此外，SDA的扩增产物序列两端含有内切酶的识别序列或其残端，无法进行克隆；产物不均一易出现拖带现象等。

3 单引物等温扩增技术

SPIA技术是近些年报道的一种新的核酸等温扩增技术[13]，产物为单链DNA，已成功应用于食源性致病菌的检测[14]。YANG等[15]利用SPIA技术快速检测苹果汁中的酸曲霉，检出限低至4.8 CFU/mL。GUO等[16]将SPIA与快速等温检测分析相结合用于检测B组链球菌DNA，检出限低至102copies/mL。可在不开盖的情况下在紫外辐射下直观判定结果，由于产物不能用作扩增目标，因此在一定程度上可避免气溶胶污染，操作简单、快速、灵敏，适用于基层企业机构。

SPIA技术引物数量少、扩增效率高，SPIA扩增产物因缺少大部分5′端引物区序列使产物DNA无法与引物发生结合，可减少扩增产物的污染。但杂合引物的设计与合成相对复杂，且不能对扩增反应进行实时定量分析，需对起始模板量定量时，只能通过其他方法如荧光定量PCR进行分析。

4 滚环等温扩增技术

RCA是于1995年被开发的一种核酸等温扩增技术[17-19]，可分为线性扩增和指数扩增两类[20]，其目的序列的检测也有两种方式，当模板为环状单链DNA时，直接检测扩增信号即可[21]；当模板为线性单链DNA时，则需利用锁式探针和连接酶对模板进行人为环化，继而检测扩增信号。有研究表明适配体探针可增强RCA的扩增信号[22]。TENG等[23]利用适配体/免疫组合的电化学生物传感器模型检测海产品中的副溶血性弧菌，检测限低至2 CFU/mL，且在不同生产批次的电极上重复性良好。GE等[24]将金纳米颗粒沉积在电极上，同时结合RCA技术将靶物质和适体结合的信号特异性放大，实现鼠伤寒沙门氏菌的超灵敏检测，检出限低至16 CFU/mL，重复性好，且不易受基质的影响。

RCA反应具有特异性强[25]、可检测到特定信号以及高通量检测的特点，但RCA反应易受到复杂基质条件的影响。再者，RCA扩增效率易受锁式探针杂交以及探针与模板连接效率的影响。RCA反应在扩增时背景信号干扰问题严重，检测效率低[26]。无论是指数扩增还是线性扩增，都要求模板为环状，过程繁琐，耗时费力[27]。

5 跨越式滚环等温扩增技术

SRCA是由河北农业大学生物检测技术创新团队开发的一种新型体外核酸等温扩增技术[28-29]。对于线性DNA的扩增，在BstDNA聚合酶作用下，添加若干个碱基合成单链DNA，从而跨过模板链两端的“缺口”，形成非闭合环。继而将先前合成的互补链置换下来，被置换下来的单链就像“卷尺”一样不断被拉长。同时，暴露出引物结合位点，引物与之结合并延伸，扩增产物为以靶序列和添加序列为单元的多个重复序列。SRCA技术目前已成功应用于食源性致病菌的检测中。YANG等[30]利用该技术检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，灵敏度为7.8 fg/μL。张蕴哲等[31]将SYBR Green I荧光染料与SRCA技术相结合实现了对扩增结果的可视化鉴定。

该技术与RCA技术相比，无需锁式探针和连接酶以及人为环化过程，操作步骤简单，成本降低约3/4；与LAMP技术相比，所需引物数量减少，避免了引物之间的相互作用，成本降低约1/2，可通过测序验证扩增结果的正确性。但SRCA技术也存在一定的不足，该技术需进行大量的预实验筛选出1对特异性强的引物。此外，该技术在以往的研究中都是定性检测，且主要是对单一目标菌株的研究。该技术目前应用范围主要集中在食源性致病菌的检测，针对掺假、转基因、过敏原的检测与鉴定尚在开发中。

6 等温扩增技术的比较

本研究将上述5种等温扩增技术进行对比，详情见表1，相比于最先发展起来的PCR技术，等温扩增技术摆脱了对昂贵且精密的温度循环设备的依赖，更加适用于基层企业。对于核酸等温扩增技术，引物的设计是关键，引物的特异性与数量都与扩增结果的准确性紧密相关。对于引物数量而言，SPIA技术仅需1条引物，最大可能的降低了引物自身的干扰问题；而LAMP反应引物数量多，易发生非特异扩增。对于反应温度而言，SDA技术与RCA技术所需温度不高，相比于其他技术更容易发生扩增反应，但也因此在试验操作过程中，需严格控制环境温度。对于反应时间而言，SRCA技术反应更加快速。对产物类型而言，LAMP技术、RCA(指数扩增)技术以及SRCA技术扩增产物均为双链DNA，最为稳定，易于检测，但也易造成交叉污染；SPIA技术、SDA技术及RCA(线性扩增)技术扩增产物则为单链DNA。

表1 五种等温扩增技术的对比Table 1 Comparison of five isothermal amplification techniques

7 等温扩增技术的共性问题及解决措施

等温扩增技术的共性问题主要体现在以下几个方面：(1)无法区分死活菌。等温扩增的靶标为核酸，而无法判断核酸的来源。(2)检测病原菌种类有限。目前应用最多的是对1种或2种病原菌核酸的检测，若要同时检测多种病原菌则需加入多对引物，引物自身易相互反应而影响扩增的准确性。(3)前处理耗时费力。杂质的存在会造成碱基间氢键的损伤，影响引物与靶基因的结合，因此需经富集、提纯等操作来降低蛋白质等杂质的干扰，步骤繁琐，耗时长，还会导致信噪比降低。(4)易出现非特异性扩增。等温扩增反应在短时间内大量扩增靶标的同时对于非靶标序列也进行了快速扩增。

随着对等温扩增技术研究的不断深入与改进，针对以上问题也有了一些改进方法。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)可选择性的穿过死细胞的细胞膜与dsDNA发生不可逆的交联反应，抑制后续扩增反应的进行，因此可区分死活菌[32-34]。LYU等[35]首次将PMAxx染料与qLAMP结合，用于食源性VBNC状态病原体的检测，为大量食品现场快速检测提供了一种新方法。等温扩增技术与微流控芯片技术相结合可实现核酸高通量快速检测，操作简单快速，成本低。李伟昊等[36]使用FTA滤膜直接对样品进行处理，并制备模板DNA，无需进行繁琐的前处理操作，缩短时间约12 h。针对气溶胶污染问题，可在反应体系中加入羟基奈酚蓝实现闭管检测；一次性检测装置的开发与使用也大大降低了气溶胶污染的影响；此外，还可向反应体系中加入液体石蜡以减少交叉污染[37]。针对假阳性问题，ZHANG等[38]开发了一种CRISPR/Cas12a系统可消除假阳性结果，此外，该研究中使用的尿嘧啶DNA糖基酶也可有效防止DNA扩增子的污染[39]，此方法较为新颖，在分子检测中具有巨大的应用潜力。TIAN等[40]巧妙地将RCA和LAMP相结合，RCA产物可直接用于LAMP反应，仅需一种聚合酶，无需任何样品转移步骤，即可在一个步骤中同时进行RCA反应和LAMP反应，灵敏度得到显著提高。针对产物分析中拖带现象，可通过优化体系中各离子的浓度减少此现象的发生[41]。

8 小结

等温扩增技术的研究范围不仅仅局限于病原菌的检测，还可应用于其他领域。LAMP技术还可应用于临床病原微生物、DNA病毒、RNA病毒、真菌、胚胎性别鉴定以及转基因等领域中；RCA技术还可应用于细胞原位检测、单核苷酸多肽分析以及测序等方面；SPIA技术还可应用于基因表达分析、基因突变分析以及核酸测序等方面；SDA技术还可应用于丙型肝炎病毒及临床疾病诊治等领域中；SRCA技术还可应用于食品中转基因、过敏原及掺伪成分的检测等。等温扩增技术的开发与应用弥补了传统培养技术和PCR技术的不足。新的等温扩增技术也在不断崛起，我国自主研发的重组酶等温扩增技术也逐渐发展起来，河北农业大学生物检测技术创新团队自主开发的SRCA技术目前也正处于多领域开发应用中。相信在今后的研究发展中，等温扩增技术的检测机制会变得更加智能化、节约化、便携化。