5株双歧杆菌代谢产物及细胞中脂肪酸构成的气相色谱—质谱分析

陈拾旸 刘风英 陈会民 陈历俊 陈树兴

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 洛阳市种子管理站，河南 洛阳 471002；3. 洛阳市农产品检测安全检测中心，河南 洛阳 471002；4. 国家母婴乳品健康工程技术研究中心，北京 100163；5. 北京市乳品工程技术研究中心，北京 100163)

人体肠道内众多的微生物菌群能够通过多种途径影响其他人体器官的功能，从而影响人体的健康状况，其变化与肥胖、糖尿病、心血管类疾病等密切相关[1]。研究发现，不仅益生菌本身，其代谢产物的抗病毒能力[2-3]及在食品加工中的应用[4]也都具有较大的科学价值。作为人和动物肠道益生菌群的重要组成部分，双歧杆菌不仅具有抗肿瘤、延缓人体衰老等生理功能[5]，而且还能够抑制炎症细胞因子表达、参与抗生素的生物合成等[6-7]。

脂肪酸是生物体的代谢产物成分之一，是其不可缺少的能量和营养物质。其中，饱和脂肪酸(SFA)对人体有提供能量、抑制肿瘤病毒生长等功能[8-10]；不饱和脂肪酸中的单不饱和脂肪酸(MUFA)具有降血糖、调节血脂[11]和保护心血管[12]等作用，多不饱和脂肪酸(PUFA)具有维护神经细胞结构、预防心脑血管疾病和对抗肥胖等生理功能[13-15]。

不同的微生物具有其独特的脂肪酸谱，研究[16]证明，细菌脂肪酸谱分析可以作为一种快速的细菌鉴定技术。Shim等[17]对9株细菌的细胞脂肪酸进行了分析，认为通过细菌细胞脂肪酸鉴定细菌是一种可靠的方法。Ines等[18]通过气相色谱—真空紫外分光度法分析测定了细胞脂肪酸构成，通过主成分分析和聚类分析后，根据其脂肪酸谱成功对27种细菌进行了分类。

目前，国内外对双歧杆菌的研究多集中在胞外多糖及蛋白特性[19-20]等方面，少数研究了双歧杆菌胞内脂肪酸的构成[21]，而对其代谢产物中脂肪酸构成的研究未见报道。试验拟研究不同双歧杆菌代谢产物及细胞中脂肪酸的构成，以期为后续双歧杆菌功能和营养方面的研究及其脂肪酸指纹图谱的建立提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

假小链双歧杆菌BP-1(BifidobacteriumpseudocatenulatumBP-1)、长双歧杆菌BL-3(B.longumBL-3)、动物双歧杆菌BA-5(B.animalisBA-5)、婴儿双歧杆菌BI-38(B.infantisBI-38)：实验室保存菌株；

动物双歧杆菌A6(B.animalissubsp.LactisA6)：中国农业大学食品科学与营养学院教育部—北京市共建功能乳品重点实验室保存菌株；

双歧杆菌BS培养基(不含琼脂)：青岛海博生物技术有限公司；

37种脂肪酸甲酯混标：色谱纯，美国Sigma公司；

正己烷：色谱纯，西陇化工股份有限公司；

乙酸、乳酸、硫酸、氢氧化钠、甲醇：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱—质谱联用仪：TSQ9000型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

气相色谱仪：7890A型，安捷伦科技(中国)有限公司；

干式氮吹仪：YY-N100型，上海允延仪器有限公司；

超净工作台：BBS-SDC型，济南鑫贝西生物技术有限公司；

高压蒸汽灭菌锅：TYAIB型，宁波久兴医疗器械有限公司；

真空冷冻干燥机：LGJ-10D型，北京四环科学仪器厂有限公司；

台式高速冷冻离心机：H1850R型，湖南湘仪离心机有限公司；

分析天平：ATY124型，日本岛津有限公司。

1.3 双歧杆菌的代谢产物样品及细胞样品的制备

从保藏菌株的甘油管中按体积分数2%的接种量分别转接5株双歧杆菌于200 mL双歧杆菌BS液体培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，继代培养3次。将所得菌液在4 ℃ 下以8 000 r/min离心10 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤去除菌体后转移至离心管中，作为代谢产物样品于4 ℃ 下保存备用；在菌体沉淀中加入5 mL 0.9%生理盐水，用移液枪抽吸数次使菌液呈均匀浑浊状态，4 ℃，8 000 r/min 离心5 min，重复以上清洗3次，收集菌体后真空冷冻干燥得到各双歧杆菌菌粉，即细胞样品。

1.4 双歧杆菌的代谢产物中乙酸、乳酸含量的测定

根据许强等[22]的方法。

1.5 双歧杆菌的代谢产物及菌体中脂肪酸的测定

1.5.1 脂肪酸甲酯化 根据徐敏等[23]的方法，略作修改。准确量取3 mL代谢产物样品置于10 mL具塞比色管中，加入2 mol/L氢氧化钠甲醇溶液2 mL，混匀后于70 ℃水浴加热10 min；取出比色管，冷却至室温后加入3 mL 正己烷，混匀后萃取，静置分层后，用移液枪吸取正己烷至10 mL离心管中，氮气吹干后加入体积分数10%的硫酸甲醇溶液2 mL进行甲酯化处理，反应温度为70 ℃，时间为15 min；反应结束后冷却至室温，加入1.5 mL 正己烷混匀，静置分层后，取1 mL正己烷相(上层清液)经0.22 μm微孔滤膜过滤到进样瓶中，密封后于-20 ℃保存备用。

同样准确称取50 mg各双歧杆菌细胞样品至10 mL具塞比色管中，进行上述相同处理得到甲酯化的细胞脂肪酸样品备用。

1.5.2 色谱和质谱条件 根据仲玉备等[24]的方法，修改如下：

(1) 色谱条件：采用SP-2560 毛细管柱(100 m×0.25 mm，0.20 μm)；升温程序：100 ℃保持12 min，以20 ℃/min 升至150 ℃；以2.5 ℃/min升至180 ℃；以0.8 ℃/min 升至196 ℃，保持10 min；以2 ℃/min升至220 ℃；以10 ℃/min升至240 ℃，保持6 min；载气(Ar)流速1.2 mL/min，进样口温度220 ℃；进样量1 μL；分流比10∶1。

(2) 质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度240 ℃；离子源温度280 ℃；质量扫描范围m/z35～400。

1.5.3 37种脂肪酸定性定量测定 将37种脂肪酸甲酯混标标品分别以稀释10，20，50，80，100倍进样1 μL，通过计算得到各脂肪酸的标准曲线。

各个样品采用同样条件进样，定性方法采用与37种脂肪酸甲酯混标的保留时间比对和NIST谱库检索；定量方法采用标准曲线法计算得到各样品的脂肪酸含量。

1.6 数据处理与分析

每组试验做3次平行，所有试验结果以“平均值±标准差”表示。试验数据采用DPS软件进行差异显著性分析，差异显著性水准选用0.05。

2 结果与分析

2.1 37种脂肪酸甲酯混标的GC-MS分析

图1为稀释10倍进样得到的37种脂肪酸甲酯混标总离子色谱图。由图1可知，各组分分离状况良好，已达到对脂肪酸进行定性及定量分析的要求。

2.2 5株双歧杆菌代谢产物中乙酸、乳酸的浓度

乙酸、乳酸浓度比值是否大于1，是判断其是否为双歧杆菌有机酸代谢产物的标准[25]。5株双歧杆菌代谢产物中乙酸和乳酸的浓度如表1所示。其中乙酸浓度为28.325～29.430 mmol/L，各菌株之间差异显著(P<0.05)；乳酸浓度为12.825～13.765 mmol/L，在菌株BL-3、BI-38之间差异不显著，但均显著低于其他3组(P<0.05)。另外，各双歧杆菌代谢产物中乙酸浓度均大于乳酸浓度，与田芬等[26]的研究结果相一致，且乙酸和乳酸的浓度比为2.085～2.295。研究发现，植物乳杆菌产生的乙酸和乳酸，不仅是其主要抑菌代谢物[27]，而且还能够增强人体抗病毒免疫能力[28]，所以，双歧杆菌代谢产物中高浓度的乙酸和乳酸对其起抑菌能力及抗病毒免疫能力的评价或许具有重要参考作用。

表1 5株双歧杆菌代谢产物中乙酸、乳酸的浓度†

2.3 5株双歧杆菌代谢产物中的脂肪酸构成

5株双歧杆菌代谢产物中的脂肪酸检测结果如表2所示。长链饱和脂肪酸(LCSFA)中的C16:0、C18:0和C24:0质量浓度均较高，3种脂肪酸之和占总脂肪酸质量浓度的81.67%～83.54%，为各双歧杆菌代谢产物中主要脂肪酸，且3种脂肪酸质量浓度在A6与BA-5组间差异显著(P<0.05)；另外，C16:0在5组组间差异显著(P<0.05)，5组中C16:0与C18:0的质量浓度比值为2.607～3.120。短链饱和脂肪酸(SCSFA)中，丁酸(C4:0)质量浓度在各菌株代谢产物中均较高，其在人体中具有提供能量、修复肠黏膜，改善肠道消化及屏障等功能[29-30]。中链饱和脂肪酸(MCSFA)C6:0、C8:0、C10:0、C11:0、C12:0质量浓度在各组间无显著差异。各菌株代谢产物PUFA中，亚油酸(C18:2n-6c)质量浓度均较高，研究[31]发现，人体膳食补充亚油酸有助于改善心衰；另外，总PUFA和总MUFA质量浓度在菌株BP-1代谢产物中均最高，且均显著高于BL-3、BA-5和BI-38(P<0.05)，而在A6中最低。此外，共有19种脂肪酸在质量浓度上均有至少2组组间差异显著(P<0.05)，且LCSFA、MUFA和PUFA总质量浓度均有3组组间差异显著(P<0.05)。因此，不同双歧杆菌脂肪酸质量浓度在代谢产物之间差异较为明显，且同种不同源的双歧杆菌菌株之间(动物双歧杆菌A6和BA-5)也存在着一定的脂肪酸差异。

已有学者[32]证明，健康的代谢与家族寿命息息相关，因此，具有诸多益生作用的双歧杆菌，其代谢也与肠道的健康有着密不可分的关系。Yaron等[33]发现，富含高β-棕榈酸酯的奶粉显著增加了婴儿肠道中双歧杆菌的数量，从而对婴儿肠道微生物区系产生有利的影响。试验中各双歧杆菌代谢产物中棕榈酸质量浓度都比较高，有可能作为其调节肠道微生物区系功能的评价指标之一。

2.4 5株双歧杆菌细胞中的脂肪酸构成

5株双歧杆菌细胞中的脂肪酸检测结果如表3所示。

表2 5株双歧杆菌代谢产物中脂肪酸测定结果†

LCSFA是各菌株细胞中主要脂肪酸，其中又以C16:0、C18:0、C24:0占比较大，为各菌株细胞主要脂肪酸，与Veerkamp[21]研究结果相似。SCSFA中C4:0含量在各组间无显著差异。MCSFA如C12:0与食用植物精油联用可消除食源性病原体，从而可显著提高食品的微生物安全性[34]，试验发现C12:0在长双歧杆菌BL-3细胞中含量最高，且显著高于菌株A6、BP-1，因此，长双歧杆菌BL-3在提高食品安全性方面具有一定的参考价值。MUFA在菌株BL-3中的总含量与BA-5、A6、BP-1无显著差异，但显著高于BI-38(P<0.05)。总PUFA含量在各组间无显著差异。与代谢产物相比，各菌株细胞中未检测出芥酸(C22:1n-9)、二十四碳烯酸(C24:1n-14)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)。另外，在各菌株细胞中，共有11种脂肪酸在含量上均有至少2组组间差异显著(P<0.05)，且仅有MUFA在BL-3、BA-5中的总含量显著高于BI-38(P<0.05)。因此，细胞之间不同双歧杆菌脂肪酸含量有一定差异，相比较于代谢产物中的脂肪酸含量，各菌株细胞内的脂肪酸含量更低，其间的差异更小。

表3 5株双歧杆菌细胞中脂肪酸测定结果†

细菌细胞内脂肪酸主要存在于细胞壁上，其脂肪酸种类和含量比例具有细菌种属遗传稳定性，可作为鉴定细菌种类的特征标记[35]。双歧杆菌细胞脂肪酸的构成不仅与其抗冻性有关[36]，而且还能提高其在有机发酵乳中的存活率[37]。通常情况下，细菌的生长条件也会影响其脂肪酸的构成，所以使用完全相同的培养条件来培养生物体有时甚至更为重要[38]。因此，要想通过分析细菌细胞脂肪酸以达到对其进行分类鉴定的目的，除了在保持完全相同的生长条件下及参考脂肪酸种类和含量上的比例之外，还应从多角度和多方向上对其进行多元统计分析，最终才能形成更为科学的理论支撑。

3 结论

研究发现不同双歧杆菌脂肪酸含量在代谢产物之间差异较为明显，在细胞之间有一定的差异，同种不同源的双歧杆菌菌株之间(动物双歧杆菌A6和BA-5)也存在着一定的脂肪酸差异，且各双歧杆菌细胞内的脂肪酸含量比代谢产物中更低，其间的差异更小。棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、二十四烷酸(C24:0)为5株双歧杆菌代谢产物及细胞中的主要脂肪酸；各菌株代谢产物中，C16:0在5组组间差异显著(P<0.05)，C16:0与C18:0的质量浓度比(ρC16:0∶ρC18:0)为2.607～3.120、乙酸和乳酸的浓度比(C乙酸∶C乳酸)为2.085～2.295。另外，与代谢产物相比，各菌株细胞中未检测出芥酸(C22:1n-9)、二十四碳烯酸(C24:1n-14)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)。后续可对双歧杆菌脂肪酸指纹图谱的构建作进一步研究。