芦笋原液中苹果酸单晶的提取与表征

崔晶晶，朱晓煊，黄展鹏，赵 琰

(河北科技师范学院化学工程学院，河北 秦皇岛，066600)

芦笋(Asparagus)口感爽滑[1]，且含有丰富的矿物质、氨基酸[2]、多糖[3]、甾体皂苷类[4]以及黄酮类等营养成分，近年来在食品和医药领域受到较大关注。例如：朱兴磊等[5]以类似1型糖尿病的大鼠为研究对象，通过注射芦笋老茎皂苷来研究其对血糖的影响，结果表明该皂苷能够有效降低大鼠餐后血糖；何云山等[6]通过对比芦笋与降脂理肝汤对高脂饮食小鼠肠道消化产生的影响，其结果显示芦笋汁的摄入能够显著降低肠道酶的活性。随着芦笋中越来越多的营养成分的发现，科研工作者们对于芦笋提取的研究也取得了一定进展。崔守富等[7]通过超声波-微波法从绿芦笋茎中提取多糖，其中粗多糖提纯率为4.23%；孟晓萌等[8]采用微波超声协同萃取方法成功提取芦笋废弃物中的黄酮类物质，结果表明，其提取率可达0.4%。综上，虽然目前提纯分离方法有很多种，但由于天然产物成分的复杂性，通过传统超声萃取的方法，已经很难制备出纯度较高的有效成分。因此探讨芦笋的高效分离方法变得尤为重要。

目前，结晶是常用的低能耗和高效的分离提纯方法，由于其三维周期性结构特点，在成核及生长过程中，杂质分子一般较难嵌入到晶格结构当中，因此产物多具有高纯度的特点，常应用在药品、精细化工、食品添加剂和化肥等各个化工领域[9～12]。陆贻超等[13]采用重结晶法对2,5-呋喃二甲酸进行提纯，通过调整不同比例的溶剂组成，培养相应单晶并解析其结构，结果表明采用N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺混合溶剂可使其纯度提升为99.98%；李改真等[14]采用熔融结晶法对通过化学反应而制得的对苯二甲酰氯进行提纯，其产物纯度高达99.9%以上。综上可知，结晶技术对于分离复杂的有机混合物，制取高纯度的化合物具有重大作用。为此，笔者拟采用结晶法对芦笋原液进行初分离。首先将芦笋原液经过脱蛋白、醇沉、抽滤、再取滤渣经真空冷冻干燥得到高纯度芦笋多糖粉末，并在不同溶剂中配置成饱和溶液。然后采用单晶培养法培养出单晶晶体，并使用PXRD，SXRD和SEM对其进行表征，最后根据其空间结构数据进行晶习模拟。

1 试验部分

1.1 药品与仪器

试验中使用的药品及仪器详情见表1和表2。

表1 从芦笋原液中提取苹果酸单晶的试验用药品

表2 从芦笋原液中提取苹果酸单晶的试验用仪器

表3 从芦笋原液中提取苹果酸单晶的试验条件

1.2 试验方法

本次实验采用溶剂挥发法和冷却法进行单晶培养。首先将芦笋原液预处理，获得的芦笋粗产品的多糖保留率为56%[15]。然后称取过量的芦笋多糖粉末，分别与不同溶剂进行混合(表3)，温度控制在25～30 ℃，持续搅拌2～3 h，直至其达到平衡。之后取上层饱和清液，放置于样品瓶中，一部分缓慢降温至室温后恒温培养1～15 d，使其自发成核结晶，另一部分迅速移至4 ℃冰箱冷藏降温培养1～15 d，使其冷却结晶。每天进行1次观察，直至样品瓶底部有晶体出现，并对其进行单晶衍射分析和晶体结构解析。

1.3 表征方法

1.3.1PXRD分析采用日本理学D/Max-2500pc型X-射线衍射仪对样品进行物相分析，以CuKα靶辐射为光源，管压为40 KV，管流为200 mA，波长0.154 056 nm，2θ扫描范围为10°～80°，扫描速度为8°/min，扫描步长为0.02°。

1.3.2SEM分析采用日立SU8010对晶体进行形貌分析，其操作电压为15 kV和1 kV，并在氮气保护的条件下间歇喷金。

1.3.3SXRD分析采用日本理学株式会社的X射线全面探测衍射仪Rapid-Rigaku II对样品进行衍射分析，以MoKα靶射线进行扫描，扫描波长为7.103×10-8m，利用Rapid auto (Rigaku, 2004)收集衍射数据，并通过SHELXS-97和SHELXL-97程序进行结构解析和修正。

2 结果与讨论

2.1 单晶培养结果

通过观察记录1～15号样品保留1～15 d后发现，在以丙酮，氯仿，乙醇，丙酮-水(乙醇、氯仿)体系，氯仿-水体系，乙醇-氯仿体系为溶剂配制的饱和溶液中，由于溶液挥发过于迅速而且多糖溶解量较少等原因，未发现有晶体存在现象；在以乙醇-水体系为溶剂配制的混合溶液中，通过冷却法出现少量细小晶体，而采用缓慢挥发法却未出现明显晶体(表3)。未产生单晶是由于多糖本身为混合物，其结晶反应与聚合物结晶类似，所以多糖分子未能通过分子有序运动达到大量出晶的条件；在纯水配制的饱和溶液中，经过冷却结晶后出现了形状规则，大小适中的大颗粒晶体，但由于多糖粉末中含有较多杂质，因此无法判断该单晶的分子式，需通过后续检测与表征才能进一步确认其分子结构及晶体结构。

2.1 PXRD结果与分析

首先对多糖原料及所获单晶进行衍射分析，结果表明，该衍射峰中存在生长较好的晶体，其衍射峰较为明显(图1)。除此之外，图中的衍射基准线略有上升，因此可预测经过脱蛋白处理后的多糖粉末当中同时存在无定型粉末与晶体产品。为进一步确定该晶体产品的成分及其晶体结构，采用单晶培养的方法对该晶体进行成分及结构分析。单晶晶体的粉末衍射结果见图2：其中(a)～(c)分别代表溶剂为纯水，乙醇与水体积比为1∶1和1∶2。通过对比发现，从水溶液(图2 (a))和乙醇水混合溶液(图2 (b)和图2 (c))中所得晶体的衍射峰位置和衍射峰强度基本一致，即它们的晶体结构相同，为同一种物质。但粉末衍射图谱推导晶体结构存在一定的局限性，其无法准确判断该晶体的空间构型及分子排布，因此需进一步分析其晶习晶型。

图1 芦笋多糖粉末的X-射线粉末衍射图

图2 单晶的X-射线粉末衍射图：a-水, b-V(乙醇)∶V(水) =1∶1, c-V(乙醇)∶V(水) =1∶2

2.2 SEM形貌研究

图3(a)为单晶的SEM图，图3(b)为单晶的局部放大图。SEM结果表明，该单晶为块状结构，长径比相对较大，晶面完整且各晶面相对平整；局部放大图显示，晶面存在部分缺陷，但未发现明显的晶体错位生长现象[16](图3(b))。

图3 待测晶体的SEM图: (a)为单晶图片, (b)为单晶的局部放大图

2.3 单晶结构解析

通过分析SXRD所测定的单晶数据，并利用SHELXS-97和SHELXL-97程序进行该单晶晶胞结构解析及修正(表4)。结果表明，该物质的分子式是C4H8O6，为L-苹果酸一水合物，属于正交晶系，P212121空间群，相对分子量为152.10。其详细晶胞参数为：a=0.558 13 (11)nm，b=0.981 9 (2)nm，c=1.179 4 (2)nm，α=90°，β=90°，γ=90°，晶胞体积V=0.646 3 (2) nm3，晶胞内分子数Z=4，即每个晶胞当中含有4个苹果酸一水合物分子(图4(b))。其中，2号位碳为手性碳，因此该晶体属于由左旋苹果酸分子结合形成的空间群(图4(a))。

表4 单晶的晶体学数据和结构精修结果

依据单晶解析结果，可以获得该单晶内部的分子连接形式(图5)。单晶解析结果表明，苹果酸一水合物单晶中的分子间通过O6—H6A…O1形成的氢键连接在一起或者通过弱H-H作用力(H1…H6A)和弱的相互作用力连接在一起(图5(a))；另一个水分子与苹果酸分子通过氢键O6—H6B…O3或者通过水分子中的氢键和弱H—H作用力(H3…H6B)连接成片(图5(b))。片与片之间通过苹果酸分子间氢键O5—H5…O2或者水和1个苹果酸分子通过(O3—H3…H6B)连接在一起(图5(c)，图5(d))。苹果酸分子同时作为溶剂分子的氢的供体和氢的受体，由此可见，在晶体结构形成过程中苹果酸分子和水分子都发挥着重要的作用。

图4 苹果酸的分子结构图(a)和晶胞结构图(b)

图5 苹果酸单晶的晶体结构以及结构中的氢键

图6 利用MS软件模拟的单晶的晶体结构(a) BFDH模型, (b) AE模型

2.4 晶习预测

利用Materials Studio(MS)软件中的Morphology模块当中的AE模型和BFDH模型模拟晶体形貌，并与SEM图进行对比。结果表明，通过BFDH模型模拟得到的晶习的晶面较多，与实际晶体形貌差异较大，其原因可归结于BFDH模型忽略了分子间作用力和外部环境对于晶习的影响(图6)。而AE模型充分考虑了晶体内部的结构单元以及其相互作用对晶习的影响，因此所获得的结果与晶体SEM图较为接近，其微小差异来源于未考虑溶剂分子对于晶习所产生的的影响。综上，AE模型可以较好的预测L-苹果酸—水合物的晶体形貌。

3 结 论

本次研究采用结晶技术和单晶培养方法从芦笋原液中提取单晶并对其进行表征，得出以下结论：

(1)通过单晶培养法成功地从水及乙醇-水混合溶剂中获得单晶，并经XRD证实所有单晶具有相同的衍射峰，为同一种物质；经SEM分析确定该晶体呈块状结构，晶面完整，无错位生长现象。

(2)通过对该晶体进行单晶解析，确定其分子式为C4H8O6，为苹果酸一水合物，属于正交晶系，P212121空间群。该单晶的晶胞参数为：a=0.558 13(11) nm，b=0.981 9(2) nm，c=1.179 4(2) nm，α=90°，β=90°，γ=90°。每个晶胞中含有4个苹果酸分子和4个水分子，分子之间通过氢键、弱H—H作用力和弱的相互作用力连接成片，片与片之间主要通过分子间氢键进行连接。因此，氢键在晶体结构形成的过程中发挥着重要的作用。

(3)通过AE模型和BFDH模型对晶习进行预测，结果表明，AE模型模拟的结果与扫描电镜的结果吻合的较好。

本次试验成功地从芦笋原液中提取出L-苹果酸单晶，其纯度为100%。本次试验结果表明，结晶方法在提纯高纯天然产物活性分子方面的具有应用价值。