外泌体在眼科疾病中的研究进展

罗家伟，张国伟，康丽华，管怀进

0引言

外泌体(exosomes)是一类直径50～150nm的细胞外囊泡，主要起源于细胞质内的多泡小体(multivesicular bodies，MVBs)[1]。外泌体的分泌受神经酰胺[2]、钙离子浓度[3]、Rab蛋白[4]等多因素调控。外泌体携有蛋白质、脂质、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)、微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)和脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)等多种生物活性分子，并能转运至靶细胞中，调控靶细胞的功能[5]。外泌体与多种眼科疾病的发生发展相关，本文总结了外泌体在角膜损伤、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)、青光眼、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)及葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)中的研究进展。

1外泌体概述

1.1外泌体的起源细胞内组分可通过依赖转运必需内体分选复合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)的途径与不依赖ESCRT的途径被特异性地转运进细胞内体中[5]，形成含有许多管腔内膜泡(intraluminal vesicles，ILVs)的内体，即MVBs。当MVBs膜与细胞膜融合时，这些ILVs被释放到细胞外，即为外泌体[6]。

1.2外泌体的提取方法针对外泌体的密度、尺寸和表面抗原等特征，有多种提取外泌体的方法，如梯度超速离心法、聚乙烯二醇共沉淀法、密度梯度超速离心法、尺寸排阻色谱法、免疫捕获法等[7]。上述方法在外泌体的得率和纯度上各不相同。针对不同的实验目的和样本类型，需选择适当的提取方法。

1.3外泌体的特征大部分外泌体共同携带的蛋白[8]包括四跨膜蛋白超家族(如CD63、CD9、CD81)、热休克蛋白家族(如热休克蛋白70、热激同源蛋白70)、ESCRT相关蛋白(如Alix、TSG101)，上述蛋白常被选作鉴定外泌体的特异性标志物。透射电子显微镜可观察到外泌体呈直径50～150nm，且周边隆起中央凹陷的圆形“茶托样”形态[9]。纳米粒子追踪分析技术常用于分析样品中外泌体的尺寸分布和密度[9]。

2外泌体与眼科疾病

外泌体可在泪液[10]、房水[11]、玻璃体液[12]和血液[13]等眼部体液中稳定存在，在调节眼部细胞迁移[14]、增生、凋亡[15]、免疫反应[16]和血管生成[17]等方面发挥重要作用。外泌体与角膜损伤、DR、ARC、青光眼、ARMD及UM等眼病关系密切。

2.1外泌体与角膜损伤角膜的透明和完整对视力至关重要。角膜损伤后，需要及时愈合以预防眼内感染。角膜愈合涉及凋亡、增殖、分化、迁移和细胞外基质重塑等多个生物学过程[18]。新生血管形成是角膜愈合中常见的并发症。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族是一类促血管生成因子。MMP-14和MMP-2可重塑血管内皮细胞外基质，促进新生血管生长[19-20]。血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)作为诱饵受体竞争性结合血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，负调节其促血管生成作用[21]。MMP-14可降解细胞表面的VEGFR1，从而解除对VEGFA的抑制，促进血管内皮细胞增殖和迁移，诱导血管形成[14]。角膜成纤维细胞可通过外泌体将MMP-14递送至血管内皮细胞，以促进角膜新生血管的生成[22]。除了角膜成纤维细胞外泌体，角膜上皮细胞外泌体也参与调控角膜愈合。Han等[23]使用透射电镜在大鼠角膜损伤模型的角膜上皮细胞表面和角膜基质中观察到外泌体。小鼠角膜上皮细胞的外泌体可促进小鼠角膜成纤维细胞的增殖和分化，同时能促进人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖[23]。Zieske等[24]在体外构建了兔角膜后弹力层(含角膜内皮细胞)与角膜成纤维细胞三维共培养模型，并在后弹力层基质中与角膜成纤维细胞表面观察到外泌体。提示在角膜外伤愈合过程中角膜成纤维细胞、角膜内皮细胞、角膜血管之间存在潜在的外泌体介导的跨细胞通讯方式，但机制及意义尚未完全阐明。

间充质干细胞衍生的外泌体也可调控角膜愈合。Shen等[25]报道，脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC)分泌的外泌体可促进角膜基质细胞的增殖、抑制其凋亡，且促进角膜基质细胞转化为角膜成纤维细胞。ADSC来源的外泌体还可抑制角膜基质细胞中MMP的表达，诱导细胞外基质相关蛋白(如胶原蛋白、纤维连接蛋白等)的表达，促进细胞外基质的合成以抑制新生血管。Tao等[26]使用人胎盘来源间充质干细胞(human placenta-derived MSCs，hP-MSCs)分泌的外泌体孵育小鼠角膜碱烧伤伤口，发现hP-MSCs外泌体处理组角膜新生血管较对照组(PBS处理组)少，且透明性也优于对照组，角膜中促血管生成相关基因与炎症因子基因表达亦显著降低。Shojaati等[27]报道人角膜基质来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells from corneal stromal stem cells，CSSC)分泌的外泌体也可抑制小鼠角膜伤口的瘢痕形成并维持角膜透明性，且发现CSSC外泌体的保护作用可能是通过递送miRNA实现的[27]。上述结果均揭示了间充质干细胞外泌体对角膜愈合的保护性作用，但具体机制及临床应用价值仍有待研究。

2.2外泌体与糖尿病视网膜病变DR的基本病理为视网膜微血管病变，最终形成视网膜新生血管[28]。新生血管的形成与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)通透性有关。病理状态的RPE通透性增加，未成熟的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)可穿透RPE生长到视网膜中，导致视力损害。

视网膜毛细血管主要由血管周细胞与内皮细胞组成。Liu等[29]发现在糖尿病小鼠视网膜血管周细胞内环状RNA-cPWWP2A(circular RNA cPWWP2A，circRNA-cPWWP2A)表达上调，而在血管内皮细胞中表达无变化。血管周细胞中高表达的circRNA-cPWWP2A可抑制细胞凋亡，并通过外泌体以旁分泌的形式传递给血管内皮细胞。在内皮细胞中，circRNA-cPWWP2A作为分子海绵吸附miR-579，诱导血管生成素1、紧密连接蛋白、沉默信息调节因子1表达上调，增强血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。外泌体circRNA-cPWWP2A介导的血管周细胞-内皮细胞跨细胞调控可能是视网膜毛细血管在高糖环境下对抗损伤和渗漏的代偿机制，但高糖环境诱导circRNA-cPWWP2A上调的机制依然不明。

除了血管周细胞外泌体，视网膜星形胶质细胞外泌体也在DR中发挥保护作用。在激光诱导的小鼠CNV模型中，视网膜星形胶质细胞分泌的外泌体可抑制巨噬细胞的迁移和血管内皮细胞成管功能，减轻视网膜血管炎症和渗漏[17]。在视网膜星形胶质细胞外泌体中发现有12种抗血管生成因子(如内皮他丁)表达。抑制视网膜星形胶质细胞的内皮他丁表达后，其分泌的外泌体的抗视网膜血管渗漏作用消失[17]。提示视网膜星形胶质细胞外泌体可能是通过递送抗血管生成因子来发挥保护作用的。

血-视网膜屏障的完整对避免DR中的视网膜血管渗漏至关重要。视网膜内皮细胞是组成血-视网膜屏障的重要部分。Zhang等[30]发现，糖尿病大鼠血浆中血小板衍生的外泌体显著增加，且血小板外泌体中CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)也显著上调。糖尿病大鼠的血小板外泌体可向视网膜内皮细胞递送CXCL10激活TLR4信号通路，抑制超氧化物歧化酶活性，诱导活性氧产生和氧化损伤，破坏血-视网膜屏障。而体外构建的高表达miR-126的人间充质干细胞外泌体，可向视网膜内皮细胞传递miR-126抑制高迁移率族蛋白B1信号通路，减轻高血糖诱导的视网膜炎症[31]。上述研究结果为DR治疗提供了新思路。

过氧化物酶体增殖子激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ)是一种促血管生成因子，它可诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)上调，刺激新生血管形成。在增殖性DR患者的房水、玻璃体液和增殖膜中PPARγ表达上调，且表达量与视网膜纤维增生程度正相关[12]。HUVECs分泌的外泌体也含有PPARγ。提示PPARγ可能由血管内皮细胞经外泌体释放到房水和玻璃体液中，调控新生血管生成。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)具有抗血管生成作用[32]。RPE细胞可定向地从顶端区分泌携带PEDF的外泌体，而基底侧几乎不分泌[33]。提示RPE衍生的外泌体可能在DR中发挥抗新生血管作用，但具体机制依旧不明。

2.3外泌体与年龄相关性白内障ARC是全球首位致盲性眼病，表观遗传调控是ARC重要的影响因素。miRNA在ARC患者与晶状体透明的正常对照者所捐献眼球的晶状体上皮细胞中差异表达[34-35]，通过调控晶状体上皮细胞靶基因参与ARC的病程[36]。Dismuke等[11]从ARC患者房水外泌体中检测出多种miRNA，推测房水外泌体可能通过递送miRNA调控晶状体靶基因，影响ARC的病程。但出于伦理原因Dismuke等未检测正常人的房水外泌体，因此无法证明在ARC患者与正常人房水中外泌体miRNA的差异表达。Chen等[37]检测了合并高度近视与未合并高度近视的ARC患者房水中外泌体miRNA表达谱，但也不能反映ARC患者与正常人房水外泌体miRNA的表达差异。因此房水外泌体miRNA在ARC中的意义仍不清楚。

2.4 外泌体与青光眼青光眼作为全球第二位致盲性眼病，病理性高眼压是其主要危险因素。根据前房角形态及病因可分为原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)和原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)。POAG与小梁网细胞外基质重塑导致的房水流出通道受阻有关[38]。前文提到外泌体可携带MMP[22]，提示外泌体可能参与POAG的细胞外基质重塑。Han等[39]报道，POAG的发病与小梁网细胞的侵袭小体有关。侵袭小体是一种细胞膜伪足，表面含多种蛋白水解酶，参与降解细胞外基质。Hoshino等[40]报道，在侵袭小体形成过程中，特定的外泌体亚群被转运到侵袭小体内，当抑制外泌体相关基因后，可阻断侵袭小体形成及细胞外基质降解。Sung等[41]发现细胞迁移也依赖外泌体的释放。提示外泌体可能调控小梁网细胞的迁移、侵袭和细胞外基质重塑，但参与POAG发病的机制仍不明了。

MYOC基因是POAG重要的致病基因，在小梁网及睫状肌中高表达[42]。MYOC基因编码myocilin蛋白，可调控小梁网细胞外基质沉积[43]、小梁网细胞形态[44]、睫状肌细胞外基质重塑[45]，是调节房水流出阻力的重要因子。房水中含myocilin蛋白，且主要存在于外泌体中[46]。小梁网细胞与睫状肌细胞可通过房水外泌体实现信息交流[47]。Stamer等[48]发现来源于房水和小梁网细胞株的外泌体中都有myocilin蛋白。地塞米松可诱导人小梁网细胞株分泌的外泌体中myocilin蛋白显著增加。提示小梁网细胞外泌体myocilin在POAG和糖皮质激素相关性青光眼中具有潜在作用。

青光眼还与眼部炎症有关[49]。人色素上皮细胞系19(adult retinal pigment epithelial cell line-19，ARPE-19)受白细胞介素1B刺激后，其分泌的外泌体可诱导单核细胞分泌多种炎症因子(如白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α等)，并促进单核细胞凋亡[16]。炎症因子诱导的ARPE-19外泌体亦可抑制T细胞增殖。提示RPE细胞外泌体可能参与减轻青光眼相关炎症反应。

青光眼病程中的高眼压会诱发视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡，造成不可逆的视力损害。间充质干细胞外泌体不仅在角膜损伤中[26]，也在RGCs损伤中发挥保护作用。骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可向受损的RGCs运输脑源性神经营养因子、神经生长因子和血小板源性生长因子，促进RGCs的存活和再生[50]。间充质干细胞外泌体对RGCs的保护作用为治疗青光眼并发症提供了新思路。

2.5外泌体与年龄相关性黄斑变性ARMD表现为RPE、Bruch膜和脉络膜毛细血管的退行性病变[51]。局部慢性炎症和补体旁路途径失衡是ARMD的病理基础[52]。当RPE细胞氧化应激时，外泌体可带走RPE细胞表面的免疫调节因子(如CD46、CD55、CD59等)，使RPE细胞表面缺乏免疫调节因子而更易受到补体攻击[53]。提示RPE外泌体可能参与ARMD相关的补体免疫。

Bruch膜是脉络膜与RPE之间的屏障。ARMD患者的RPE功能失调导致Bruch膜发生破坏，脉络膜毛细血管易穿透Bruch膜生长到视网膜形成CNV，一旦累及黄斑区，会导致严重的视力损伤。Xu等[15]报道，人脐带胚胎干细胞分泌的外泌体可抑制缺氧RPE细胞的迁移与凋亡，为治疗ARMD提供了新思路。在ARMD早期，随着RPE的功能失调，黄斑区出现Bruch膜变薄和RPE下脂质与蛋白沉积，形成软性玻璃疣[51]。在ARMD患者的视网膜玻璃疣中有外泌体标志物CD63，且与玻璃疣相关淀粉样蛋白存在共定位[54]。体外研究发现，RPE细胞氧化损伤后溶酶体功能失调，胞吐作用增强[54]。提示RPE细胞外泌体可能参与构成ARMD患者视网膜玻璃疣。此外，细胞外基质重塑与玻璃疣及新生血管密切相关[55]。RPE细胞会定向地从基底侧分泌含解整合素样金属蛋白酶10(a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10)的外泌体[33]。ADAM家族被发现参与细胞外基质重塑[56]。提示RPE细胞外泌体可能参与调控ARMD中的细胞外基质重塑。

为探索外泌体对ARMD的诊断价值。Kang等[57]从ARMD患者的房水中提取到外泌体，发现与单纯ARC患者相比，ARMD患者房水外泌体中组织蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)上调。接受抗VEGF单克隆抗体治疗后，患者房水外泌体中CTSD降低。在ARPE-19体外损伤模型的外泌体中也检测到CTSD上调。Voisin等[58]发现在ARMD患者和对照者(眼底检查正常，无视网膜玻璃疣或色素变性，且无ARMD家族史)提取的RPE多能干细胞中，ARMD组的CTSD表达量更高。提示房水中的外泌体CTSD可作为判断ARMD进展的标志物。Klingeborn等[13]使用免疫亲和捕获法(以CD81作为抗原靶点)提取并比较了ARPE-19上清外泌体、人血浆外泌体、原代培养的猪RPE细胞顶端分泌的外泌体的蛋白表达谱，发现血浆外泌体与ARPE-19细胞外泌体蛋白表达谱有显著差异，且在血浆外泌体中未发现RPE细胞特异性的蛋白。由于尚未发现ARMD的血浆外泌体生物标志物，仍需寻找更具RPE细胞特异性的外泌体免疫捕获靶点。

2.6外泌体与葡萄膜黑色素瘤UM是成年人最常见的眼内恶性肿瘤。外泌体可激活免疫系统调控UM的转移。非转移性UM可分泌外泌体至肿瘤细胞转移前微环境，递送PEDF激活单核细胞，并招募自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)至肿瘤细胞转移前微环境。同时诱导巨噬细胞极化，并上调其肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的表达。NK细胞和巨噬细胞均参与清除UM细胞，从而抑制非转移性UM的远处转移[32]。而转移性UM分泌至肿瘤细胞转移前微环境的外泌体缺乏PEDF，却携带有间质上皮转化因子[59]，能诱导血管渗漏和新生血管形成，促进UM转移与生长。此外，Ragusa等[60]发现在UM患者玻璃体液中的外泌体miR-146a比对照者(正常健康眼球捐献者)上调，且UM患者的血清外泌体中miR-146a同样相对正常健康对照者升高。提示血清外泌体miR-146a有望成为UM诊断的潜在标志物。

3总结和展望

作为一种普遍存在的跨细胞通讯方式，外泌体具有在细胞间传递生物活性分子调控靶细胞的功能。在免疫、退行性疾病、肿瘤、血管生成等各个领域，外泌体已成为研究热点。近年来，虽然在眼科疾病相关领域外泌体研究取得了一些进展，但仍相对处于起步阶段。外泌体研究技术的进步及眼科交叉领域的外泌体研究进展，势必会对眼科外泌体研究起到极大的推动作用。随着对外泌体在眼科疾病发生发展中作用的认识不断深入，外泌体有望成为眼病治疗的新兴靶点，也为眼病的诊断与预后提供了新思路。