土壤高效解钾菌的筛选鉴定及烟草栽培应用效果评价

高加明，张健行，佘梦林，王 冬，陈守文，马 昕

（1.湖北省烟草专卖局，武汉430000；2.无锡药明康德新药开发股份有限公司，江苏 无锡214100；3.湖北大学生命科学学院，武汉430062）

烟草是中国重要的经济作物之一，烟叶生长期间各种营养元素尤其是钾元素的供应对烟叶的产量和品质具有关键影响［1］。钾元素缺乏会导致烟叶尖端和叶缘处呈黄绿色晕斑或者红铜色、棕褐色坏点，叶片发软，叶缘下卷，页面凹凸不平，严重时部分叶肉呈黄色，叶缘干枯残破［2］。目前，针对烟草的缺钾症一般采取地施钾肥或者叶片喷施磷酸二氢钾溶液的方法进行矫正和防治［3］。然而，传统化肥的大量施用容易造成土壤板结、酸化、微生物类群失衡［4］、土传病害加重［5］等严重的土壤问题，给农业生产带来了一定的损失。在该情况下，生物钾肥作为新型环保肥料逐步进入人们的视野［6］。

生物钾肥是一种新型的钾细菌肥料，其主要成分为解钾细菌［7］。该肥料能够利用解钾细菌在土壤中的繁殖与活动对含钾矿物进行分解，将难溶性钾转化为可供植物吸收利用的可溶性钾［8］。目前所报道的解钾菌主要有胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilagi⁃nosus）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）和土壤芽孢杆菌（Bacillus edaphic）等，而其中又以胶质芽孢杆菌的解钾效率及环境适应能力最强［9，10］。近年来的研究表明，解钾菌分解矿物的机理具有多样性，包括分泌有机酸、降解酶类以及通过分泌胞外多糖对矿物颗粒进行吸附、包裹后再通过菌体代谢产物溶蚀等多种方法［11］。解钾菌对作物生长的影响主要表现为提供作物生长所需的钾等矿质营养，促进生长、改善作物品质、增强作物抗逆性等。Postma等［12］将解钾菌施用于土壤后，土壤速效钾含量从86.57 mg/kg上升至99.60 mg/kg。陈彦春等［13］在烟草大田施用生物钾肥后，烟叶株高、叶宽、叶面积显著增加，烟叶产量提高了17.2%。韦忠等［14］的研究结果表明，添加生物钾肥处理的烟叶烟碱、总氮含量最低，烟叶含钾量显著提升，且致香物质增多。

解钾细菌因其独特的生物活性已成为生态农业可持续发展的优势菌株，且常被制作成菌肥应用于农业生产［15］，但目前大部分解钾菌仍然面临着解钾能力弱、定殖时间短、密度低、对作物促生效果不稳定等问题。本研究旨在通过筛选高效解钾菌株，并考察其在烟草根际土壤中的定殖稳定性、释钾效果和对烟草的促生效果，为解钾细菌菌肥的开发及其在烟草种植中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及原料

1）菌种筛选土壤。湖北省武汉市华中农业大学实验田表层土壤、华中农业大学狮子山林地表层土壤、湖北省恩施州烟田表层土壤等，样品编号后放置4℃冰箱保存。

2）烟草盆栽土壤。烟草盆栽土壤取自华中农业大学实验田的黄棕壤，土壤取回后121℃灭菌1 h，晾干后捣碎过筛，称重后装盆。经测定其各项营养元素浓度分别为有机质36.3 g/kg、总氮1.1 g/kg、全钾13.5 g/kg、速效磷39.8 mg/kg、缓效钾1 065.6 mg/kg、速效钾132.7 mg/kg、pH 7.2。

1.1.2 培养基

1）解钾菌分离培养基。蔗糖5.0 g/L，NaH2PO4·12H2O 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO30.5 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 7.0～7.5。

2）解钾菌筛选培养基。蔗糖10.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，NaH2PO4·12H2O 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.1 g/L，酵母粉0.5 g/L，CaCO31.0 g/L，钾长石粉（200目）20.0 g/L，pH 7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选及鉴定取10.0 g土壤样品至90 mL

无菌水的三角瓶中，180 r/min振荡30 min，稀释后涂布在解钾菌分离培养基上，37℃恒温培养3～4 d。待长出菌落后，挑选长势较好的菌落接种到解钾菌筛选培养基平板中，30℃恒温培养7 d，从中挑取长势良好的菌株接种到斜面培养基（解钾菌分离培养基）中保存。

将初筛获得的菌株以5%接入解钾菌筛选液体培养基，30℃、180 r/min培养7 d。振荡10 min后121℃灭菌20 min，随后8 000 r/min离心15 min，上清液稀释50倍，使用原子吸收光谱仪测可溶性钾元素含量，然后计算菌株实际解钾量，计算公式：菌株实际解钾量=菌株发酵液含钾量-对照上清液含钾量。选取其中解钾能力最强的菌株进行生理生化及分子生物学鉴定。菌株的生理生化鉴定参照《伯杰氏系统细菌学手册》第九版，并以胶质芽孢杆菌LS1作为对照菌株。菌株的分子生物学鉴定参照《精编分子生物学实验指南》第四版［16］。

1.2.2 解钾菌肥的配制以麦麸为菌肥载体，烘干、磨碎过40目筛。121℃30 min连续灭菌6次。选择200目的白云母粉为含钾矿物。矿粉用去离子水清洗2遍，定量滤纸过滤后，烘干，收集矿粉。将解钾菌NGW1发酵液（发酵时间48 h，90%以上芽孢，调节体积使芽孢数为8×109CFU）加至100 g载体中，充分搅拌，调节pH至6.5～7.5。载体中的生物量理论上为8×107CFU/g。白云母矿粉依据试验设计添加。

1.2.3 盆栽试验设计对解钾菌NGW1进行了利福平抗性诱导，使之可以在200μg/mL的利福平浓度下生长，有利于定殖数量检测。烟草盆栽试验共设4个处理，每个处理重复9次，试验所施肥料有基肥、微生物有机肥、矿物钾肥。基肥包括尿素、过磷酸钙、硫酸钾，其N∶P∶K=1∶1∶3，矿物钾肥为200目白云母粉。土壤于121℃30 min条件下间歇灭菌4次。每个花盆1 kg土壤，烟苗移栽时各处理按照表1添加肥料，其中基肥溶于水后添加，解钾菌NGW1菌肥添加至烟草根围。烟苗移栽后0、10、30、45、60 d取烟草植株及根际土壤样品。烟草植株测量农艺性状后，取烟叶105℃杀青10 min，随后60℃烘干至恒重。区分不同部位烟叶，将叶脉除去，标记，磨碎过40目筛，编号，用于后续检测。土壤样品一部分用于定殖计数，另一部分自然风干后过40目筛，编号用于后续检测。

表1 不同盆栽处理的肥料施用量 （单位：g/盆）

1.2.4 数据处理采用Excel 2019和MEGA 7.0软件进行数据处理、分析和作图，用SPSS Statistics 19软件、Duncan’s新复极差法检验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 解钾菌的筛选

经过筛选获得10株在解钾菌筛选培养基平板中生长良好的菌株（表2），表中LS1为实验室保藏的具有解钾能力的胶质芽孢杆菌菌株。进一步通过液体培养检测各菌株的解钾能力，结果显示（表3），NGW1菌株发酵液上清含钾量为53.80μg/mL，显著高于其他菌株，表明在测试菌株中NGW1菌株的解钾能力最强，故选用NGW1菌株用于后续研究。

表2 不同菌株在解钾菌分离培养基上的菌落形态

表3 不同菌株在液体培养基中分解钾长石的效果（单位：μg/mL）

2.2 菌株生理生化及分子生物学鉴定

为明确NGW1菌株的种属分类，进一步对该菌株进行了生理生化特征鉴定和16S rDNA基因序列分析。结果显示（表4），NGW1菌株的生理生化特征与胶质芽孢杆菌LS1菌株一致。通过将NGW1菌株的16S rDNA基因序列与Genbank的核酸序列进行同源性比对（Blastn），结果显示，菌株NGW1同Bacil⁃lus mucilaginosus（AB255669）的相似性达99%。同相近种属模式菌株16S rDNA基因序列进行序列比对，并构建系统发育树（图1），菌株NGW1同胶质芽孢杆菌属于同一个聚类。

表4 菌株NGW1的生理生化特点

根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析方法，菌株NGW1被鉴定为胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），命 名 为B.mucilaginosusNGW1，GenBank序列号为KR297246。

图1 基于16S rDNA基因序列的系统发育树

2.3 胶质芽孢杆菌NGW1对盆栽烟草生长的影响

2.3.1 解钾菌NGW1及含钾矿物对烟草农艺性状的影响为考察解钾菌NGW1对烟草生长是否有促进作用，测定了不同处理下盆栽烟草的农艺性状。结果显示（表5），整个烟草盆栽时期，ML1、ML2和ML3处理的烟草植株的有效叶数、株高、最大叶宽、茎围均高于CK。

移栽30 d时，CK植株的株高、最大叶长、最大叶宽和茎围分别为（20.50±2.12）cm、（15.70±2.11）cm、（11.50±1.42）cm和（2.70±0.53）cm，其中添加解钾菌的3个处理植株的株高和茎围均显著高于CK，且以ML3处理的植株长势最好，其株高、最大叶长、最大叶宽和茎围分别为（26.30±3.12）cm、（15.31±2.30）cm、（12.32±0.63）cm和（4.07±0.45）cm，相比于CK，ML3处理的株高、茎围分别提高28.29%和50.74%。

移栽45 d时，CK植株的株高、最大叶长、最大叶宽和茎围分别为（23.40±1.69）cm、（17.17±0.81）cm、（12.62±0.91）cm和（3.11±0.38）cm。随着菌株的生长，添加解钾菌肥的3个处理植株的株高、最大叶长、最大叶宽和茎围数据均优于CK。长势最好的ML3处理植株的株高、最大叶长、最大叶宽和茎围分别为（30.33±2.31）cm、（19.87±1.50）cm、（14.98±0.58）cm和（4.51±0.41）cm，比CK分别提高29.62%、15.73%、18.70%和45.02%。

移栽60 d时，添加解钾菌的3个处理植株的多项农艺性状数据仍显著大于CK，其中生长最好的ML3处理的株高、最大叶长、最大叶宽和茎围分别为（35.34±2.52）cm、（22.33±1.53）cm、（17.65±2.08）cm和（4.63±0.45）cm，比CK分别提高51.61%、20.05%、29.11%和25.82%。

表5 不同处理对盆栽烟草农艺性状的影响

2.3.2 解钾菌NGW1及含钾矿物对土壤和烟叶含钾量的影响为考察解钾菌在盆栽土壤中的解钾能力以及解钾菌肥施加是否能促进烟草吸收和积累钾元素，检测了不同盆栽处理中土壤和烟叶的含钾量。结果显示（图2），添加解钾菌肥的各处理土壤总含钾量均高于CK。在30、45、60 d时，CK土壤总含钾量分别为13 448.6、13 372.6、13 371.2 mg/kg。30 d时添加解钾菌肥的ML1、ML2、ML3处理土壤总含钾量分别为13 453.6、13 472.8、13 475.5 mg/kg，60 d时土壤总含钾量分别为13 383.6、13 404.8、13 405.5 mg/kg（图2A）。在0 d时，各处理土壤缓效钾初始含量均为1 065.6 mg/kg（图2B），在30、45、60 d时，CK土壤的缓效钾含量分别为1 078.6、1 105.8、1 068.7 mg/kg，添加解钾菌肥的ML1、ML2、ML3处理土壤的缓效钾含量在45 d达最高，分别为1 128.6、1 163.2、1 169.8 mg/kg，均显著高于CK（图2B）（P＜0.05）。在30～60 d时速效钾含量呈下降趋势，这可能是由于所施钾肥主要是速效钾，在短期内烟草不能消耗完全，多余的速效钾向缓效钾转换，当土壤中的速效含钾量不足时，缓效钾又开始转换为速效钾供植物利用。在整个观测周期内，各处理中土壤速效钾一直呈下降趋势（图2C）。0 d时，速效钾初始含量均为132.7 mg/kg，在团棵期（30 d）、成熟期（60 d）和采摘期（90 d）CK土壤速效钾含量分别为110.6、69.5、68.7 mg/kg；90 d时ML1、ML2、ML3处理的土壤速效含钾量分别为89.2、87.6、80.4 mg/kg，均显著高于CK。该结果表明解钾菌肥的施用有利于将矿物中的不可利用钾转换成为速效钾。

图2 不同盆栽试验处理对土壤总钾（A）、缓效钾（B）、速效钾（C）含量的影响

在烟草移栽后60 d内，烟叶的含钾量呈不断下降趋势，30～60 d时CK、ML1、ML2、ML3处理的中上部烟叶含钾量分别下降57.90%、48.40%、45.70%、45.10%，下降幅度由高至低排序为CK、ML1、ML2、ML3（图3A）；CK、ML1、ML2、ML3处理的下部叶含钾量分别下降20.30%、11.10%、9.80%、9.20%，下降幅度由高至低排序为CK、ML1、ML2、ML3（图3B），说明添加解钾菌NGW1及矿粉可以减缓叶片中钾流失速度。60 d时这4个处理的中上部烟叶含钾量分别为1.49%、1.81%、1.85%、1.90%，添加解钾菌的处理ML1、ML2、ML3中上部烟叶含钾量分别比CK高21.48%、24.16%、27.52%（图3A）。60 d时这4个处理的下部叶含钾量为1.43%、1.52%、1.56%、1.57%，添加解钾菌的处理ML1、ML2、ML3下部烟叶含钾量分别比CK高6.29%、9.09%、9.79%（图3B）。以上数据说明解钾菌有利于烟叶中钾素积累。ML2和ML3处理的中上部烟叶含钾量与ML1相比差异不显著，下部烟叶含钾量与ML1相比差异显著，分别高出ML1处理2.63%、3.29%，说明在添加解钾菌基础上添加矿粉有利于烟叶含钾量的进一步提高。

图3 不同处理对盆栽烟草中上部叶（A）和下部叶（B）含钾量的影响

2.3.3 胶质芽孢杆菌NGW1在烟草根际土壤中的定殖为考察解钾菌NGW1能否在烟草根际稳定定殖，测定了NGW1菌株在盆栽烟草植株根际的活菌数。结果显示（表6），添加菌肥后1 d，盆栽根际土壤计数结果显示3个处理中，NGW1菌株数量为4.46×107～5.11×107CFU/g。添加菌肥后20 d，ML1、ML2和ML3处理的NGW1细胞数量下降2个数量级，分别为（1.72±0.39）×105CFU/g、（2.47±0.21）×105CFU/g、（2.59±0.31）×105CFU/g。添加菌肥30 d时，3个处理的根际活菌数分别回升至（4.67±0.46）×105CFU/g、（4.50±0.46）×105CFU/g、（5.33±0.12）×105CFU/g。在30～60 d时段内，根际活菌数逐步降低，至检测结束时（60 d）3个添加菌肥处理的土壤根际活菌数分别为（2.27±0.31）×105CFU/g、（2.77±0.15）×105CFU/g、（3.15±0.23）×105CFU/g。以上数据说明，以麦麸为载体配制的胶质芽孢杆菌菌肥能够与化学肥料混合施用，NGW1菌株在烟草根际能够稳定定殖且具有较高的定殖密度。

表6 NGW1菌株在盆栽烟草根际的定殖情况

3 讨论

烟草是喜钾植物，因此钾对烟草有重要的生理作用［17，18］，其含量是评价烟叶品质的重要指标。由于土壤钾素供应的限制，烟叶中的钾难以达到高含量。中国规定烟叶含钾量2%以上为优质烟。李强等［19］分析了中国烟叶的含钾量，结果表明，河南、黑龙江等地区烟叶平均含钾量仅为1.31%～1.45%，与优质烟草相比存在一定差距，促进烟草对钾元素的吸收利用对国内烟草品质的提升具有重要意义。本研究CK中上部烟叶含钾量为1.49%，下部烟叶含钾量为1.43%，与河南、黑龙江等地区烟叶平均含钾量相近，添加解钾菌NGW1后各部位烟叶含钾量均显著上升，表明该菌肥可以有效促进有效钾含量较低地区烟草对钾元素的吸收利用。此外，本研究的结果还显示，随着烟草生长时间的增长，烟叶的钾含量逐渐减少，且烟叶钾含量的流失主要发生在30～45 d的时间段内，该现象与化党领等［20］总结的钾在烟草中的分配规律相符，其认为钾在烟叶中所占比例较低，约占总吸钾量的46%～49%；随着烟草株龄的增长，钾在烟叶中所占比例逐渐减少，而钾在烟茎中所占比例逐渐升高，这一现象在烟草进入成熟期后尤为明显。

含钾量的提升除了促进烟叶品质的提升外，还对烟草植株的生长具有显著的促进作用。本研究中施用解钾菌的ML1、ML2和ML3处理的有效叶数、株高、最大叶宽、茎围都显著高于CK，其中又以对株高的促进幅度最大。目前的研究显示，钾离子是烟株生命活动中60多种酶的活化剂。这些酶部分参与细胞的呼吸作用，如氧化还原酶；部分参与物质的合成代谢，如转移酶、合成酶。钾离子还参与烟株光合作用产生的同化物质的合成，如糖类合成、脂类合成、蛋白质合成等。钾元素对光合作用等同化途径的促进作用对烟草植株的生长具有关键的影响。司丛丛等［21］的研究还表明钾元素可以提高作物的抗逆性。马新明等［22］的研究表明烟草钾离子含量与烟草各级侧根的数量与生长速度呈正相关，说明钾离子可以促进烟草根系生长。由此可见，解钾菌对烟叶品质和产量的提升作用是通过促进多种相关代谢途径来实现的。

综上所述，本研究分离的胶质芽孢杆菌NGW1菌株能够通过促进土壤中矿物钾元素的释放，提升土壤中的缓效钾、速效钾含量，并促进烟草植株对钾元素的吸收，显著提升烟草株高、最大叶长、最大叶宽、茎围等农艺性状指标，提高烟叶产量及品质。