肉种牛冷冻精液生产

方焱秋,顾达夫

长春市新牧科技有限公司，吉林长春 130000

长春市新牧科技有限公司种公牛站，成立于1996 年，是集纯种肉种牛冻精生产、科研与教学基地为一体的公司，这里有国内一流的肉用种牛、基础设施和科技队伍。现存栏种公牛115 头，大部分为纯种加拿大品系的西门塔尔种公牛，是全国加系存栏最多的种公牛站。2020 年生产优质冻精200万剂，冻精除满足本省需求外，还远销全国各地，广泛受到市场欢迎。对推动肉牛产业化进程起到了积极作用。冷冻精液的技术，主要用于猪、牛、鹿、马等动物上。冻精可长期保存于液氮中，按需随用随取。具有保存成本低、效率高、运输方便的特点，是大规模遗传改良的主要手段。现在就肉种牛冷冻精液生产技术做以下介绍。

1 实验室要求

仪器：相差显微镜、喷墨灌装一体机、冷冻仪、密度仪、平衡柜、电子天平、水浴锅、鼓风干燥箱、培养箱、液氮罐等。室温:20 ～24 ℃。

2 精液要求

原精要求：原精量≥3 mL，密度≥6 亿/ mL，活力≥0.65，畸形率≤0.15，原精颜色气味无异常，方可用于冻精生产。

0.25 mL 微管冻后要求：有效精子数≥800万个，畸形率≤0.18，冻后活力≥0.35，剂量≥0.18ml，细菌数≤800个，细管无裂痕，封口严密，字迹清晰，信息齐全（包括单位名称、公牛品种、注册号、生产日期）。样品中任何一项未达到标准要求，均视为不合格产品，做销毁处理。

3 原精检查

将集精杯置于30 ～34 ℃水浴锅中，对颜色、气味、精液量、活力和密度指标进行检测。

3.1 颜色气味

正常的颜色应为乳白色或微黄色，气味略腥；不正常的颜色偏红为血精，颜色偏黄为有炎症，建议兽医治疗；集精杯里如果有粪便或草渣为污染精液，可能存在细菌超标。以上不正常的原精均弃掉。

3.2 精液量

分为称量法和目测法两种方法，称量法比目测法更为精确。①称量法：按照精液比重1.04 换算成毫升，公式：采精量（mL）=[总重量（g）-集精杯重量（g）]/1.04。②目测法：通过读取集精杯刻度毫升数。

3.3 活力

按百分率判定，差值5%。取集精杯中部精液一小滴于38 ℃载玻片上，加盖玻片，让其自然展开，置于500 倍相差显微镜下观察其活力，至少8 个视野。看其图像观察：①精子的饱满程度，运动速度和运动轨迹。②畸形的精子主要有发育不全的精子，头部畸形、颈部畸形或尾部畸形。③原生质滴的形态及数量。④背景的清晰度。这些因素都会影响精子的耐冻性，从而影响冻精质量。符合要求的精液进行稀释生产。

3.4 密度

使用精子密度仪进行密度测定，根据原精量和活力数值测定出每毫升精液中的精子密度，计算稀释量进行稀释。

3.5 生产台账

及时记录生产台账，项目有：公牛号、原精量、密度、活力、稀释量、生产细管数、冻后活力。

4 稀释、分装、平衡

4.1 稀释液配制及稀释

4.1.1 稀释液配制

4.1.1.1 自配稀释液

①称量药品→加双蒸馏水溶解后定容→过滤→消毒。

②取a 液→加甘油→加卵黄→加抗生素→搅拌→待用。

4.1.1.2 进口稀释液制备

原液→加双蒸馏水→搅拌→待用。

4.1.2 稀释精液

原精各项指标合格后，方可进行稀释。高倍稀释时，先进行低倍稀释，以防止因过快改变生存环境造成伤害，也叫稀释打击。先取原精3 倍的等温稀释液（30 ～34 ℃），倾斜沿集精杯壁，缓慢加入集精杯中，冲洗3 次倒入稀释瓶中。置于室温（20 ～24 ℃）自然降温10 min 后，再用室温稀释液加至总量。混匀后，用喷墨打印一体机进行灌装。

4.2 分装

细管要求字迹清晰，信息齐全，封口严密。

4.3 平衡

精子的平衡温度为4 ℃，是稀释后的精子在降温和低温下的一个适应过程，目的为保护精子突然遭受低温打击。封口后的细管精液上架放入平衡柜3 ～4 h 平衡，要求摆放方向一致，棉塞封口端靠近操作者，以便下一步操作。

5 冷冻

精液冷冻时，对温度变化非常敏感，冷冻温度不适宜直接造成精子死亡。

冷冻仪：设定温度-120 ℃，精液由平衡柜4℃直接转入冷冻仪-120 ℃冷冻8 min，温差大，精子冷打击大，冻后活力稍差。

全自动冷冻仪：设定最佳冷冻曲线（见图1），精液由平衡柜4 ℃转入冷冻仪4℃进入冷冻程序，8 min 由4 ℃降温至-140 ℃。快速越过冰晶危险区域（0 ～-60 ℃），进入玻璃化状态，（-130 ℃以下）使精细胞免受冰结晶冻害，精子复苏率高。

图1 精液冷冻曲线

冷冻仪与全自动冷冻仪的对比试验：经HAMILTON THORNE(精子分析仪)检测：原精活力81.97%，全自动冷冻仪冻后活力为55.06%，冷冻仪冻后活力为51.14%，两台仪器冻后差异为3.92%。

6 冻后检测

6.1 外观：细管无裂痕封口严密。

6.2 冻后活力检测：迅速从液氮中提取冻精放入38 ℃水浴锅30 s 解冻。推针推入小试管摇匀后，取1 小滴于38 ℃载玻片上，加盖玻片。自然展开置于500 倍相差显微镜下，观察视野中呈直线前进运动精子占总精子数的百分率，观察四个视野以上，进行综合评定，≧0.35 的视为冻精活力合格。冻后合格的精液装入液氮生物容器，待质检部检测畸形率、有效精子数、剂量、细菌数等各项指标合格后，转入销售部门销售，反之销毁处理。

7 消毒

7.1 高温消毒：玻璃器皿。

7.2 紫外线消毒：包装袋、细管、枪头。

7.3 75%酒精消毒：胶塞、鲜鸡蛋、盖玻片、载玻片。

7.4 巴氏消毒：稀释液。

8 季节对精子的影响

种公牛对高温天气的反应，这种现象叫热应激。热应激会造成精子活力的下降，直接影响精子的品质：死精、畸形精子数量增加。在冻精生产过程中，精子抗应激能力减弱。这时根据精子耐冻情况，适当减少稀释量来保证产品质量。

9 冻精生产的注意事项

9.1 温度：精子对温度的变化十分敏感，它只能在一定时间一定温度范围内存活，过高或过低都会导致精子受损甚至死亡。

9.1.1 牛体温→采精内胎温度38 ℃→水浴锅温度30 ～34 ℃→室温20 ～24 ℃→平衡温度4 ℃（3 ～4 h）→全自动冷冻仪4 ～-140 ℃（冷冻曲线）→液氮生物容器-196 ℃。在整个冷冻精液生产中，温度逐步下降禁止温度回升。

9.1.2 以精液温度为标准，调节所需稀释液和器皿温度。精液容器做好明显的信息标记。

9.2 时间：原精送入实验室后，应尽快迅速准确操作，减少由于时间长精子活动代谢消耗能量，造成活动能力减弱或死亡。

9.3 光照：对排除体外的精子，光照是有害的。光能在精子内引起光化反应，产生对精子有害的过氧化氢。因此精液稀释处理应尽量减少和避免光的照射。

9.4 包装好的冷冻精液，由一个液氮生物容器转换到另一个容器时，停留时间不得超过5 s。

9.5 冻精检测合格，按照品种、牛号分别储存在液氮生物容器中，定期检查，保证液氮充足。

冷冻精液的生产，是一项严谨精细的工作，只有将精液产品保存在适当环境条件下操作，才能生产出合格冻精。

总而言之，冷冻精液的生产，极大减少了种牛的饲养数量，节约成本，最大限度地提高优秀种公牛的利用率和覆盖率，充分发挥良种公畜的遗传潜力，对推进肉牛产业化进程具有重大意义。