UPLC-MS/MS法快速测定婴幼儿配方奶粉中的L-肉碱

刘玲君，何香婷，翟红梅，房新平*，白素琴

1.河北三元食品有限公司，河北省母婴特膳及乳制品技术创新中心（石家庄 050000）；2.北京三元食品股份有限公司，白素琴首席技师工作室（北京 100163）

L-肉碱（L-carnitine），化学名为3-羧基-4-N-三甲基-氨基丁酸（3-hydroxy-4-N-trimethyla minobutyrate），是一种在人体中广泛存在的类氨基酸，主要分布在肌肉、心脏中，其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸燃烧，为机体提供能量[1-3]，人体不仅可通过食物获取L-肉碱，且在体内可自行合成[4]，但婴幼儿自身合成能力较低，因此必须在婴幼儿食品中补充。

GB 10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》规定，L-肉碱为可选择性加入成分，规定最小添加量为0.3 mg/100 kJ[5]。婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的检测可采用GB 29989—2013[6]分光光度计法，但由于显色液配制复杂，乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶不稳定，使检测结果重复性差，且检出限较高，为0.6 mg/100 g。文献报道的L-肉碱检测方法主要有酶显色法[7-9]、离子色谱法[10-11]、高效液相色谱法[12-14]等。

建立UPLC-MS/MS法快速测定婴幼儿奶粉中L-肉碱含量，该方法分析速度快，操作步骤简单，避免复杂步骤造成的目标物的损失，灵敏度高，重复性好，适用于企业大批量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴配奶粉（质控样品）。

左旋肉碱标准品（CAS 541-15-1，纯度＞98%，Sigma公司）；浓盐酸（分析纯，利安隆博华天津医药化学有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司）；冰乙酸（优级纯，天津市光复科技发展有限公司）；甲酸（色谱纯，Dikma公司）；乙腈、甲醇（均为色谱纯，Fisher chemical公司）；试验用超纯水（Millipore Milli-Q系统净化蒸馏水获得）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290 LC/6420 MS液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源，美国安捷伦公司）；KQ3200 DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PB-10 pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AL 204-IC电子天平、XS 2050U电子分析天平（特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为CORTECS HILIC（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），柱温25 ℃，进样量2 μL，流速0.3 mL/min，以甲醇-0.1%甲酸（体积比20∶80）为流动相。

1.3.2 质谱条件

离子源采用电喷雾（ESI）离子源；正离子扫描模式；扫描方式为多反应监测（MRM）；毛细管电压4 kV；雾化气和碰撞气采用高纯氮；干燥气流速10 L/min，干燥气温度350 ℃，质谱分析参数见表1。

表1 L-肉碱的质谱分析参数

1.4 样品的前处理

准确称取1.00 g（精确到0.1 mg）混合均匀的样品于100 mL三角瓶中，加入10 mL 0.1 mol/L盐酸和30 mL水，超声提取15 min，用4%氢氧化钠调节pH 4.5，定容至100 mL，过滤，滤液过0.22 μm滤膜，上机进行液相色谱-质谱分析测定。

1.5 标准溶液的配制

标准储备液的配制：称取1.00 g（精确到0.1 mg）L-肉碱于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解定容、混匀，得到质量浓度10 mg/mL的标准储备液。

标准工作液的配制：取奶粉空白试样，按照1.4小节的前处理方法得到的滤液作为溶剂，配制系列标准工作液，将L-肉碱标准储备液逐级稀释得到质量浓度10，50，100，200，500和1 000 mg/L的标准工作液，现用现配。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

肉碱是一种小分子强极性化合物，没有特殊的紫外吸收，先前的研究都是通过衍生化反应来减少L-肉碱的极性，使其带有生色团的同时更适合于在反相条件的保留，试验不需衍生，分别对比C18柱、C4柱和HILIC柱的分离效果，结果发现C18柱和C4柱基本在死时间出峰，且拖尾现象严重，而HILIC柱保留时间适中，峰形很好，见图1，适合定量分析。

图1 HILIC柱对L-肉碱的多反应检测色谱图

2.2 质谱条件的优化

L-肉碱分子结构中含有季铵碱性基团，适合用电喷雾离子源，正离子检测方式，L-肉碱的准分子离子[M+H]+质核比为m/z162.2，选择其作为母离子并进行下一步碰撞诱导解离，对碰撞能量、碎裂电压、干燥气流速、温度进行优化。二级质谱显示信号最强烈的碎片离子质核比为m/z103.1，85.2和60.3。由图2可知，信号最高的m/z103.1碎片离子可作为定量离子，其次是m/z60.3作为定性离子，最终质谱分析参数见表1。在检测过程中，采用切换法，将L-肉碱出峰前和出峰后的色谱柱流出液导入废液通道，避免因离子源污染而导致信号抑制，减小信噪比，提高仪器的准确度和灵敏度。

图2 L-肉碱的ESI/MS/MS质谱图

2.3 样品前处理条件的优化

对于奶粉中L-肉碱的检测，既要保证样品的均一性，又要减少样品基质中常量目标化合物对仪器的污染。从原始固体样品中取出部分代表性样品，充分混合，用四分法缩分，准确称取样品，加入盐酸溶液进行超声提取。

试验对超声时间和最终调节的pH进行优化。

2.3.1 超声时间的优化

分别称取5份同一份样品，加入盐酸溶液后，分别超声5，10，15，20和25 min，进行检测，提取结果见图3。结果表明，超声提取时间越长，提取效果越好，但15 min后基本无变化，所以最终选择超声提取15 min。

图3 不同超声提取时间所得到L-肉碱含量

2.3.2 最终pH的选择

用氢氧化钠溶液调节pH梯度（pH 3.5，3.8，4.0，4.5，5.0和7.0），分别上机检测L-肉碱含量，结果显示只有在pH 4.5时，蛋白沉淀完全，滤液澄清，且在LC/MS/MS中色谱峰形最佳。

2.3.3 稀释倍数的选择

由于LC/MS/MS仪器灵敏度高，必须使样品进行一定倍数稀释才能使处理液中L-肉碱含量在仪器的最佳线性范围内。稀释还可使样品基质的抑制减小，使仪器的信噪比降低，提高灵敏度。最终选择在处理液定容100 mL之后，过0.22 μm滤膜，用超纯水稀释5倍。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围和检出限

用超纯水配制L-肉碱浓度系列标准溶液进行LC/MS/MS测定，以各组分响应值（Y）和相对应的质量浓度（X）作标准曲线。试验表明，L-肉碱在10～1 000 mg/L范围内线性关系良好，r=0.999 3。可以满足定量分析的需要，结果计算采用外标法定量。

取储备液逐级稀释，进样量2 μL。以信噪比S/N=3计算L-肉碱的检出限（LOD）和S/N=10计算定量限（LOQ）分别为0.000 1和0.001 mg/kg，能够满足实际样品分析对检测限的要求。

2.4.2 回收率和精密度

表2 L-肉碱的回收率和精密度（n=5）

分别取2个婴配基质奶粉样品和2个购买的质控样品，按试验方法测定其中的L-肉碱本底含量。另向奶粉样品中分别加入80，160和320 mg/kg标准品，质控样品中分别加入50，100和200 mg/kg标准品，每个样品平行测定5次，计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。质控样品检测结果，与真值99 mg/kg满足误差范围。L-肉碱加标回收率为82.43%～96.91%，相对标准偏差为1.46%～5.65%。方法显示较好的回收率及重复性，能够满足实际样品的分析要求。

2.4.3 方法重现性

通过同一仪器、同一实验员、同一天对同一质控样品按试验方法进行连续检测3 d，每天重复测定（n=5），考察方法的重现性。结果显示，方法的日内精密度为2.6%、日间精密度为5.7%，表明方法重现性良好。

3 结论

试验方法基于酸水解超声提取的高效快速，高效液相色谱-质谱法的高分离能力和高灵敏度，通过对样品前处理和液相色谱-质谱条件的优化，建立一种适用于婴幼儿奶粉复杂基质的L-肉碱的快速检测技术。方法采用CORTECS HILIC色谱柱进行分离，以甲醇-0.1%甲酸为流动相，流速0.3 mL/min，在优化条件下，样品在5 min内完成分析，分析速度快，L-肉碱在10～1 000 mg/L范围内线性关系良好，检出限低。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可用于大量婴幼儿配方奶粉样品中的L-肉碱的快速测定。