HPLC-MS/MS测定蜂花粉中4种有机磷类除草剂

郭爱静，花中霞，张弘，张世勇，王小青，王可

石家庄市疾病预防控制中心，石家庄市化学毒物检测及风险预警技术创新中心（石家庄 050011）

蜂花粉是由蜜蜂采集的花粉、花蜜以及蜜蜂的唾液分泌物加工混合而成，被誉为活性天然代谢产物的“宝库”[1-2]。蜂花粉营养非常丰富，含有氨基酸、碳水化合物、矿物质、酚类化合物和其他生物活性物质[3-4]，既是很好的天然营养食品，又具有抗菌消炎、抗癌和抗过敏等功效[5]，一直备受消费者的青睐[6]。由于花粉暴露于自然环境中，蜂花粉可以作为农药残留的生物学标记物[7]。文献中关于蜂花粉中农残的检测以杀虫剂为主[8-10]，而对除草剂残留的检测鲜有报道。

有机磷类除草剂是一类含磷除草剂，常用的有莎稗磷、甲基胺草磷、抑草磷和哌草磷等，被广泛应用于农业生产中。大部分有机磷农药属于高毒性农药，可引起急性毒性[11]；有机磷类农药还具有神经毒性，可引起神经系统紊乱，还有致畸、致癌的风险[12-13]。鉴于其危害和大范围使用，世界各国均制定了食品中有机磷农药的残留限量法规[14]，GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》中规定在稻谷、糙米中莎稗磷的最大残留量均为0.1 mg/kg[15]。

有机磷农药的主要仪器检测方法有气相色谱（GC）法[16]、液相色谱（LC）法[17]、气相色谱质谱（GC-MS）法[18]、气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）法[19]、液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法[20]等。液相色谱串联质谱在分析复杂基质样品中多组分的痕量分析方面具有高通量、高灵敏度和定性定量准确等优势。目前，有机磷农药检测种类以杀虫剂和杀菌剂为主，除草剂的检测相对较少，且分析对象以蔬菜、水果为主[16,18-19]，有关蜂花粉中有机磷类除草剂的检测研究还未见报道。试验以分散固相萃取法净化，建立了蜂花粉中4种有机磷类除草剂的高效液相色谱-串联质谱分析方法，并对净化方式、色谱条件和质谱参数进行优化。该方法准确、快速、灵敏度高、选择性好，适用于蜂花粉中有机磷类除草剂的检测分析，为开展蜂花粉中除草剂残留检测提供了技术手段。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200-6410B高效液相色谱-串联质谱仪，配ESI电离源（美国Agilent公司）；AE240电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MS3涡旋振荡器（德国IKA公司）；TG16-WS台式高速离心机（湘鑫仪器仪表公司）；EVAP-12氮吹仪（美国Organomation公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

莎稗磷（Anilofos，99.8%，德国Sigma-Alorich公司）；甲基胺草磷（Amiprofos-methyl，10 ng/μL，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；抑草磷（Butamifos）、哌草磷（Piperophos）（纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色谱纯，德国Merck公司）；甲醇、二氯甲烷（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯）、N-丙基乙二胺（PSA）（AR，美国Dikma公司）；C18固相萃取柱（上海Welch公司）；无水硫酸镁、氯化钠（AR，天津永大化学试剂公司）；试验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 混合标准系列溶液的配制

分别准确称取甲基胺草磷、莎稗磷、抑草磷和哌草磷4种标准品，用甲醇溶解配制1.0 mg/mL的标准储备溶液，保存于-20 ℃冰箱，备用。临用前用空白基质提取溶液稀释，配制成1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL混合标准溶液系列。

1.3 样品前处理

精确称取2 g蜂花粉样品，置于50 mL离心管中，加入5 mL水后混匀，静置10 min。再加入1 g氯化钠和12 mL乙酸乙酯，涡旋30 s，超声10 min，以4 000 r/min离心5 min，取出10 mL有机相转移到放有1.0 g PSA的离心管中，涡旋30 s，离心5 min，取6 mL上清液，在40 ℃下氮吹至尽干，用1.0 mL甲醇/乙腈-水溶液（75∶25，V/V）复溶后，涡旋30 s，经0.2 μm滤膜过滤，按仪器工作条件进行HPLC-MS/MS测定。

1.4 色谱条件

色谱柱，Agilent ZORBAX XDB-C18色谱柱（4.6 mm× 50 mm，1.8 μm）；流速，0.3 mL/min；柱温，30 ℃；进样量，3 μL；流动相A，0.1%甲酸水溶液；流动相B，甲醇/乙腈（50∶50，V/V）；流动相比例，75∶25（B∶A）。

1.5 质谱条件

离子源，电喷雾离子源（ESI）；扫描方式，正离子扫描；监测方式，多反应监测（MRM）；干燥气温度，350 ℃；干燥气流速，10 L/min；雾化气压力，30 psi；毛细管电压，4 000 V；碰撞气，高纯氮（N2，纯度≥99.999%）；其它质谱参数见表1。

表1 4种有机磷类除草剂的保留时间和质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

有机磷类除草剂的结构中均含有N、O等杂原子，在酸性环境中容易结合H+。因此，选择电喷雾离子源正离子模式（ESI+）进行检测。以4种有机磷除草剂标准溶液进样，以全扫描模式（Scan）筛选母离子，结果发现各化合物的[M+H]+峰均响应较强，确定为母离子；在选择离子扫描模式（SIM）下优化碎裂电压，以期母离子响应最佳；用产物离子扫描模式确定2个丰度高、干扰小的子离子作为定性离子，同时优化碰撞能，使得2个子离子获得最佳响应。每个化合物的2个定性离子中响应较高的作为定量离子，最终确定质谱条件。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

色谱柱的填料和粒径影响目标化合物的色谱分离度和峰形。试验比较了Agilent ZORBAX XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）、proshell 120 EC-C18（2.1 mm×75 mm，2.7 μm）和ZORBAX Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）3种不同型号色谱柱的分离效果。结果发现，使用ZORBAX XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）色谱柱时4种目标物的峰形和分离效果最好，分析时间也最短（见图1）。

2.2.2 流动相的选择

鉴于有机磷除草剂在酸性环境下易结合H+，因此试验在水相中加入甲酸。分别比较了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈（50∶50，V/V）-0.1%甲酸水溶液这3种不同混合体系流动相对4种目标物峰形和响应值的影响。结果表明，当有机相为乙腈时，4个目标峰的分离度较好，但甲基胺草磷响应值较低；当有机相为甲醇时，整体响应值均有提高，但目标峰的分离度相对较差；当有机相为甲醇/乙腈（50∶50，V/V）时，目标物的峰形和分离度均较好，响应也较好。因此，选择甲醇/乙腈（50∶50，V/V）-0.1%甲酸水溶液作为试验的色谱流动相。试验进一步优化了两相比例，结果发现两相比为75∶25（V/V）、流速为0.3 mL/min时，色谱峰形和分离度均较好，采用等度洗脱还节省了平衡时间，提高了工作效率。

2.3 样品提取方法的优化

2.3.1 提取剂的选择

为获得高的提取效率，试验考察了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈-乙酸乙酯混合液提取体系对4种有机磷类除草剂回收率的影响。表2显示，采用乙酸乙酯为提取剂时提取效果最好，回收率为78.7%～84.1%。因此，试验选择乙酸乙酯为提取剂。

图1 4种有机磷除草剂混合标准溶液的色谱图（100 ng/mL）

表2 提取剂对4种有机磷类除草剂回收率的影响

2.3.2 净化方式的选择

试验比较了采用分散固相萃取和C18固相萃取柱净化时4种有机磷除草剂回收率的影响。结果表明，利用分散固相萃取法净化的回收率明显优于C18固相萃取柱。试验继续比较了分散固相萃取剂为C18、PSA以及混合使用PSA与C18、PSA与MgSO4对回收率的影响。结果表明，单独使用1.0 g PSA时回收率最好，为80.6%～87.8%，具体结果见图2。

2.4 基质效应

基质效应（matrix effect，ME）是指除目标物以外的其他成分对待测物测定值的影响，在质谱使用ESI源检测时，基质主要影响目标物的离子化，使其响应信号增强的为基质增强效应，使其响应信号减弱的为基质抑制效应。试验采用同一质量浓度的4种有机磷类除草剂基质空白溶液和甲醇/乙腈-水溶液（75∶25，V/V）按照仪器条件进行测定，以响应峰面积的比值评价基质效应。ME值在80%～120%之间，表明基质效应较小；ME值低于80%或高于120%，表明有较强的基质抑制或增强作用。由表3可见，哌草磷的ME值为103.3%～108.9%，基质效应较小；其他3种有机磷类除草剂ME值为42.7%～68.3%，存在较强的基质抑制效应。因此，采用基质匹配标准溶液进行外标法定量以减少基质效应的影响。

图2 不同净化方式及净化剂用量对4种有机磷除草剂回收率的影响

表3 蜂花粉中4种有机磷类除草剂的基质效应

2.5 方法学验证

2.5.1 线性范围、检出限和定量限

用蜂花粉基质空白溶液配制4种有机磷类除草剂质量浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL的系列混合标准溶液。按照仪器条件进行测定，以质量浓度为横坐标（X，ng/mL），对应定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。在1.0～200.0 ng/mL范围内，4种有机磷类除草剂的线性关系良好，相关系数（r2）＞0.999。平行测定11个空白蜂花粉样品，4种有机磷类除草剂检出限（LOD，S/N=3）为0.02～0.05 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）为0.07～0.16 μg/kg，结果见表4。

2.5.2 方法的准确度与精密度

取蜂花粉空白样品，加标浓度分别为5，20和50 μg/kg，每个加标水平平行测定5次，计算平均加标回收率和相对标准偏差（δRSD）。由表5可知，4种有机磷类除草剂的平均回收率在72.2%～89.1%之间，δRSD在2.0%～8.9%之间。结果表明，该方法准确度较高、精密度好，可满足蜂花粉中4种有机磷类除草剂的检测要求。

表4 4种有机磷类除草剂的线性关系、检出限和定量限

表5 蜂花粉中4种有机磷类除草剂的加标回收率与相对标准偏差（n=5）

2.6 实际样品检测

采用所建立方法对石家庄市售10份蜂花粉样品进行检测。其中，4份检出甲基胺草磷，含量在0.79～4.53 μg/kg之间；3份检出莎稗磷，含量在0.19～1.58 μg/kg之间；4份检出抑草磷，含量在0.23～0.89 μg/kg之间；4份检出哌草磷，含量在3.79～33.17 μg/kg之间。结果表明，蜂花粉中存在除草剂的残留污染，相关部门应对其污染进行风险评估，加快制定蜂花粉中除草剂的相关限量标准。

3 结论

首次建立了同时检测蜂花粉中4种有机磷类除草剂（甲基胺草磷、莎稗磷、抑草磷和哌草磷）残留的HPLC-MS/MS分析方法，4种除草剂在1.0～200.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好，检出限在0.02～0.05 μg/kg之间，定量限在0.07～0.16 μg/kg之间。该方法灵敏度高、准确度和精密度好、操作简单，可满足检测要求。