毛霉型豆豉后发酵过程中的工艺优化

危梦，刘文龙，邹强，周衡刚，邵良伟，刘达玉*

1.成都大学肉类加工四川省重点实验室（成都 610106）；2.黄埔海关技术中心（广州 510730）

豆豉的后发酵过程是形成豆豉独特风味和各种功能因子的关键步骤[1]。豆豉发酵过程中蛋白质等水解生成的氨基酸、活性肽等物质是其风味的主要来源。豆豉后发酵工艺过程，对豆豉中有机酸、醇类、酯类、醛类等化合物的形成有较大影响[2]。传统自然发酵的毛霉型豆豉后发酵时间较长，一般要至少发酵1年以上，因此其风味往往比快速发酵的豆豉要好。目前工业上为了缩短生产周期，采用的是提高后发酵温度，通过高温加速各种生化反应的速度来达到缩短发酵时间的目的，但是会对风味造成一定影响。在后发酵过程中，适当的升温可以使酶反应加速，但当温度过高时，因酶的本质是蛋白质，其结构会遭到破坏，反而效果不佳[3]。

试验以在潼川传统毛霉型豆豉后发酵工艺的基础上，通过适当升温缩短发酵时间和添加乳酸菌以及酵母菌来强化后发酵工艺[4]。乳酸菌生长繁殖后，可以产生有机酸，利于酵母菌的生长繁殖，同时生成的乳酸又能与醇类合成酯及香气成分的前体物质。酵母菌可利用豆豉中的还原糖进行酒精发酵，发酵己糖生成醇类物质，结合豆豉中产生的有机酸还可生成酯类物质，从而赋予豆豉醇的香气和加速产品后熟[5]。

1 材料与方法

1.1 原辅料与试剂

黄豆，市售。毛霉菌种，由四川省成都大学药学与生物工程给学院实验室提供。

成熟豆豉曲：由制曲工艺（菌粉接种量0.21%、制曲温度17 ℃、发酵时间6 d、制曲相对湿度86% RH）制得；乳酸菌：此次试验使用的发酵乳杆菌是发酵乳酸菌的异形发酵、乳糖代谢、半乳糖等多种糖类，生成乳酸、醋酸、琥珀酸、乙醇等代谢产品。鲁氏酵母AS2.371：具有耐盐的特点，能在食盐含量低于18%的环境中生长繁殖良好，具有增香的功能；食用盐：精纯盐；白酒：选用低度白酒；醪糟：选用四川东柳醪糟有限责任公司生产的东柳醪糟。

氢氧化钠、37%甲醛、硫酸铵、丙三醇、硫酸铜、无水乙酸钠、硫酸钾等，均为国产分析纯；MRS培养基，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

GNP-9160隔水式智能恒温培养箱，常州双瑞仪器制造有限公司；SH-020恒温恒湿试验箱，上海上器集团试验设备有限公司；PHS-2 pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HSU-80手持盐度计，上海精密仪器仪表有限公司；KDN-102C凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；JA3103N电子分析天平，上海民桥精密仪器科学有限公司；WXL-30W台称，瑞安市浩展衡器有限公司；DL-2万用电炉，北京中兴韦业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验工艺参数的确定

在潼川传统毛霉型豆豉后发酵工艺的基础上，通过适当升温缩短发酵时间和添加乳酸菌和酵母菌来强化发酵，以氨基态氮含量和总酸含量为评价指标，研究不同的食盐添加量、发酵温度、乳酸菌和酵母菌接种比例、发酵时间等因素对豆豉成品氨基态氮含量和总酸含量的影响，并在单因素试验的基础上进行正交优化试验，以此来确定后发酵工艺的最佳条件[6]。

根据单因素试验的结果分析，设计L9(34)正交试验，研究食盐添加量、发酵温度、乳酸菌和酵母菌接种比例、发酵时间对豆豉质量的影响，以氨态氮含量和总酸含量作为评价指标，确定最适合的发酵条件。正交试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

1.3.2 豆豉理化指标测定

食盐含量的测定：根据GB 5009.44—2016的直接滴定法测定食盐含量；蛋白质含量的测定：根据GB/T 5009.5—2016凯氏定氮法测定豆豉中的蛋白质含量；氨基酸态氮含量的测定：根据GB 5009.235—2016进行；总酸含量的测量：根据SB/T 10170—2007进行；水分的测定：根据GB/T 62846—2016进行。

1.3.3 感官指标

由10名感觉评价员组成评价小组，按照T/GZSX 014—2018豆豉规格的感官指标进行系统评价，评价结果如表2所示。

表2 毛霉型豆豉的感官评定结果

1.3.4 验证试验

利用正交试验得到的最佳发酵工艺，在此条件下分别用5.00 kg（4组平行）豉曲进行豆豉后发酵，并对发酵结束的毛霉型豆豉的氨基酸态氮含量和总酸含量进行检测验证。

2 结果与讨论

2.1 后发酵工艺单因素的试验结果

2.1.1 食盐添加量的确定

在豆豉后发酵过程中，食盐的添加可有效抑制有害微生物的生长繁殖，能达到抑菌防腐的目的[7-8]。试验选用豉曲按确定的制曲条件（菌粉接种量0.21%、制曲温度17 ℃、发酵时间6 d、制曲相对湿度86% RH）处理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料时分别加入6.00%，7.50%，9.00%，10.50%和12.00%的食盐（每组试验3个平行），3.00%的醪糟酒，2.00%的低度白酒，发酵初期加入乳酸菌，在发酵30 d时加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接种量为2.00%，接种比例为1∶2），温度35 ℃条件下发酵60 d，测定此时豆豉的氨基态氮含量和总酸含量，确定最佳食盐添加量。

图1为食盐添加量对氨基态氮和总酸含量的影响研究结果。结果表明，当食盐添加量为9.00%时，最终产品氨基酸态氮含量最大；当盐浓度高于9.00%时，氨基酸态氮含量显著降低（p＜0.05）；当盐浓度高于10.00%时，总酸含量显著降低（p＜0.05），原因可能是低浓度时，豉曲中的蛋白酶受到盐的抑制作用较小，随着盐浓度的增加，微生物的生长受到抑制，进而影响酶系物质的活力，造成豉曲中分解产生的氨基酸等有机酸含量的减少，使得氨基酸态氮含量降低，对应的总酸含量也呈降低趋势。

图1 食盐添加量对氨基态氮和总酸含量的影响

2.1.2 发酵温度的确定

豆豉后发酵过程是大豆中的大分子物质蛋白质等在相应酵素的作用下生成氨基酸等物质的催化反应，温度过低对催化反应的进行不利，温度过高又会影响酶系统的活性，蛋白质的分解能力变弱[9-10]。试验选用豉曲按确定的制曲条件处理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料时加入9.00%的食盐、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，发酵初期加入乳酸菌，在发酵30 d时加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接种量为2%，接种比例为1∶2），在不同温度（30，32，34，36和38 ℃，每组试验3个平行）条件下发酵60 d，测定此时豆豉的氨基态氮含量和总酸含量，确定最佳发酵温度。

由图2可知，当温度为35 ℃左右时，最终产品的氨基酸态氮和总酸含量为最高，而温度继续升高，会导致氨基酸态氮和总酸含量降低。由于温度在35 ℃左右时蛋白酶活最高，蛋白酶活力高则分解蛋白质的能力强，豆豉中氨基态氮含量也对应升高，总酸含量也相应升高。因此，发酵温度选择在35 ℃左右。

图2 发酵温度对氨基态氮和总酸含量的影响

2.1.3 乳酸菌和酵母菌接种比例的确定

乳酸菌产生的乳酸可以降低体系pH，促进酵母的繁殖。酵母菌在代谢过程中，不仅通过自身分解酶系水解淀粉成己糖，而且还可通过EMP途径、无氧呼吸发酵产生酒精、甘油、糠醇、琥珀酸等物质，酒精也可以代谢成有机酸，或与有机酸等反应生成酯，这些物质都成为豆豉品香的重要来源[11]。试验选用豉曲按确定的制曲条件处理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料时加入9.00%的食盐、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，发酵初期加入乳酸菌，在发酵30 d时加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接种量为2.00%），乳酸菌和酵母菌比例分别为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3（每组试验3个平行），在温度35 ℃条件下发酵60 d，测定此时豆豉的氨基态氮含量和总酸含量，确定最佳接种比例。

为了充分发挥乳酸菌和酵母菌对豆豉发酵的优势，试验优先接种乳酸菌，然后在间隔30 d时，再接种酵母菌，两种菌总的接种量为2.00%。探究两种菌的最佳接种比例，结果如图3所示。当接种比例为1∶2左右时，豆豉成品中的氨基酸态氮和总酸含量均为最多。因此，后续正交试验考虑接种比例在1∶2左右。

图3 接种比例对氨基态氮和总酸含量的影响

2.1.4 发酵时间的确定

试验选用豉曲按确定的制曲条件处理好后，取1.00 kg成熟豉曲，拌料时加入9.00%的食盐、3.00%的醪糟酒、2.00%的低度白酒，发酵初期加入乳酸菌，在发酵30 d时加入酵母菌（乳酸菌和酵母菌的接种量为2.00%，接种比例为1∶2），在温度35 ℃条件下分别发酵45，52，59，66和72 d，测定此时豆豉的氨基态氮含量和总酸含量，确定最佳发酵时间。

从图4可以看到，随着发酵时间的增加，氨基酸态氮的含量和总酸含量逐渐增加，当发酵超过60 d时，氨基氮的含量缓慢增加而稳定，有稍稍减少的倾向，但是发酵超过60 d，总酸含量显著下降（p＜ 0.05），此时豆豉已发酵成熟。后发酵前期，由于在制曲阶段积累的蛋白酶等酶的活性高，所生成的有机酸还没有积蓄，所以抑制酶活性弱，蛋白质通过各种酵素的协调作用被分解为小分子的氮化化合物，氨基酸态氮虽然快速积累，但后发酵后期有机酸的大量增加，抑制了酶活性，激活了氨基酸。酸态氮含量的增加幅度变弱，最后趋于稳定[12]。总酸的含量随着游离氨基酸和有机酸的累积一直呈上升趋势，酸度达到一定程度后，会反过来抑制酶的活性，进而导致分解的氨基酸降低[13]。因此，后续正交试验考虑发酵时间在60 d左右。

图4 发酵时间对氨基态氮和总酸含量的影响

2.2 优化工艺条件下毛霉型豆豉成品质量检测

2.2.1 毛霉型豆豉成品质量检测

为保证优化工艺条件下生产的毛霉型豆豉的质量，检验按照优化工艺发酵的豆豉成品是否符合标准，以T/GZSX 014—2018豆豉标准为参考，对此次试验的毛霉型豆豉进行成品质量检测，结果如表3所示。结果显示所有指标均符合相关标准。

表3 毛霉型豆豉产品质量检测对照表

2.3 后发酵工艺正交优化试验结果

在单因素试验的基础上，设计L9(34)正交试验，确定豆豉最佳后发酵条工艺条件。正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。

从正交试验的结果和方差分析的结果可以看出，影响氨基酸状态氮的主要因素次序为D＞B＞A＞C，影响总酸含量的主要因素次序为B＞A＞D＞C。发酵温度和发酵时间对豆豉氨基酸状态氮的含量有着极显著的影响（p＜0.01）。食盐的添加量、乳酸菌和酵母菌的接种比例对氨基酸状态氮含量有着显著的影响（0.01＜p＜0.05）。食盐添加量、发酵温度及时间对豆豉总酸含量有极为显著的影响，乳酸菌和酵母菌的接种比例对总酸含量有显著的影响[14]。考察各因素的极差Rj值，分别确定影响两个指标因素的主次顺序，同时结合水平结果平均值Kij确定两指标下的最优因素组合；针对氨基酸态氮，最佳因素组合为A2B2C1D2；针对总酸含量，最佳因素组合为A1B3C2D2。考虑到试验是为了探究相关因素对最终产品风味品质的影响，综合平衡选择发酵的最佳组合为A2B3C1D2，即食盐添加量9.00%，发酵温度36 ℃，乳酸菌和酵母菌接种比例1∶1，发酵时间60 d。在此组合下发酵，氨基酸态氮为0.93 g/100 g左右，总酸含量为2.08 g/100 g左右。

表4 发酵条件L9(34)正交试验表

接表4

表5 方差分析

2.4 验证试验结果

采用单因素试验和正交试验得出豆豉后发酵最佳工艺条件：食盐添加量9.00%，发酵温度36 ℃，乳酸菌和酵母菌接种比例1∶1，发酵时间60 d。在此条件下分别用5.00 kg（4组平行）豉曲进行后发酵，并对发酵结束的毛霉型豆豉的氨基酸态氮含量和总酸含量进行检测。4组豆豉成品氨基酸态氮含量平均值为0.95 g/100 g，与理论值0.93 g/100 g相差0.02 g/100 g；总酸含量平均值为2.02 g/100 g，与理论值相差0.06 g/100 g，表明在此优化条件下发酵生产的豆豉方法可靠、质量稳定。

3 结论

试验以潼川传统的毛霉型豆豉后发酵过程为基础，把氨基酸态氮含量和总酸含量作为评价指标，探讨毛霉型豆豉后发酵过程中的食盐添加量、发酵温度、乳酸菌和酵母菌接种比例、发酵时间等因素对氨基态氮含量和总酸含量的影响。并利用正交试验得到最佳发酵工艺，在此条件下分别用5.00 kg（4组平行）豉曲进行豆豉后发酵，对发酵结束的毛霉型豆豉的氨基酸态氮含量和总酸含量进行检测验证。从正交试验的结果和方差分析的结果可以看出，影响氨基酸状态氮的主要因素次序为发酵时间＞发酵温度＞食盐添加量＞接种比例；影响总酸含量的主要因素次序为发酵温度＞食盐添加量＞发酵时间＞接种比例。结果表明，最佳发酵条件为食盐添加量9.00%、发酵温度36 ℃、发酵时间60 d、乳酸菌和酵母菌接种比例1∶1。在此组合下发酵，氨基酸态氮在0.93 g/100 g左右，总酸含量在2.08 g/100 g左右。该研究可为今后霉型豆豉的后发酵工艺提供一定技术指导。