响应面法优化黄刺玫果总黄酮索氏提取工艺

任婧，王晓燕，宋高林，王进东

1.山西省医药与生命科学研究院（太原 030000）；2.山西省药品监督管理局技术审评中心（太原 030001）

黄刺玫果是蔷薇科蔷薇属落叶灌木黄刺玫（Rosa xanthinaLindl.）的干燥成熟果实，黄刺玫果广泛分布于我国北方各省的山区和丘陵地带[1-2]。黄刺玫果中含有大量的维生素、多酚及总黄酮类化合物，具有理气活血、调经健脾的作用[1]。民间也有将其做成果酱或晒制成花果茶来饮用的习惯，以提高人体免疫力。据报道黄刺玫果总黄酮化合物具有抗氧化、抗血栓、降血脂等作用[3-6]。现代药理学证明，黄酮具有抑菌消炎、抗肿瘤、抗氧化、止血等作用[7-10]。当前社会，人们普遍生活节奏加快、工作压力日益增大，高血压、高血脂等疾病的发病率明显增加。因此以黄酮类化合物为基础研究针对相应疾病的预防保健品受到人们的普遍高度重视。此外，天然黄酮类化合物具有相对安全的特点，在食品加工中也广泛用作添加剂[11]。

近年来关于黄刺玫果总黄酮的研究主要集中在黄酮类成分的检测及应用，研究证实黄刺玫果中黄酮成分主要为芦丁、槲皮素及金丝桃苷等[12-13]。目前，黄刺玫果中总黄酮的提取普遍采取溶剂热回流法提取法，但耗时大、耗能高、提取效率低。索氏提取法采用溶剂回流和虹吸原理，连续动态提取物料，既节省溶剂，提高提取效率，且有效减少人工操作等优势[14]。根据前期预试验结果可知，索氏提取黄刺玫果总黄酮相比于传统的热回流提取方法，不仅节约溶剂，且提取效率高。试验通过索氏提取法对黄刺玫果进行处理，通过单因素考察提取时间、溶剂比例以及溶媒用量对总黄酮得率的影响，采用响应面法优化最佳提取工艺，提高黄刺玫果中总黄酮化合物含量为接下来进一步分离黄刺玫果总黄酮化合物提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

黄刺玫果采摘自山西省左权县（经山西大学张立伟教授鉴定）；芦丁标准品（纯度＞99%，中国食品药品鉴定研究院）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

索氏提取器、HH-6电热恒温水浴锅（北京市长丰仪器仪表公司）、LYNX-6000冷冻离心机（Thermo Fisher）、BIOMATE 3s紫外可见分光光度计（Thermo Fisher）、92SM-202A电子天平（Precisa）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制[15]

用芦丁做标准品，采用甲醇配制质量浓度0.2 mg/mL的芦丁标准品母液。吸取芦丁标准品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，于10 mL容量瓶中，分别加入2.0，1.6，1.2，1.0，0.8，0.4和0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亚硝酸钠0.5 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝0.5 mL，放置6 min；加入4%氢氧化钠4.0 mL。加60%的乙醇定容至刻度线，摇匀，放置15 min，于510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.3.2 样品中黄酮的提取及测定

将黄刺玫鲜果粉碎，称取黄刺玫果10 g，加入含有1%柠檬酸的60%乙醇80 mL[16]。利用索氏提取黄酮，提取2.5 h，过滤提取液，记录总体积数，为样品溶液。取样品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按

1.3.1 中方法操作，测定样品中黄酮得率，按式（1）所示计算黄酮得率。

式中：C为依据回归方程计算的样品中黄酮含量，mg/mL；1为测定样品滤液体积，mL；V为样品滤液总体积，mL；M为黄刺玫果质量，g。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 提取时间对黄酮得率的影响

称取5份10 g的黄刺玫果，加入含有1%柠檬酸的60%的乙醇溶液100 mL，料液比为1∶10（g/mL），提取时间分别为1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，提取黄酮，考察不同时间对黄酮得率的影响。每个试验重复3次。

1.4.2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

称取5份10 g的黄刺玫果，加入含有1%柠檬酸的不同浓度的乙醇溶液100 mL，料液比为1∶10（g/mL），提取2.5 h，乙醇体积分数分别为40%，50%，60%，70%和80%，考察不同乙醇体积分数对黄酮得率的影响。每个试验重复3次。

1.4.3 料液比对黄酮得率的影响

称取5份10 g的黄刺玫果，分别按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）加入含有1%柠檬酸的60%的乙醇溶液，提取时间为2.5 h，考察不同料液比对黄酮得率的影响。每个试验重复3次。

1.5 响应面试验设计

表1 响应面试验设计因素与水平

根据单因素试验结果，设计三因素三水平的响应面试验，以黄酮得率为响应值，确定索氏提取法提取黄刺玫果总黄酮的最佳工艺条件，如表1所示。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线，如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对黄酮得率的影响

提取时间对黄酮得率的影响见图2。

图2 提取时间对黄酮得率的影响

由图2可知，随提取时间的延长，黄酮得率逐渐上升，在2.5 h时，黄酮得率最高，其值为5.725 mg/g，随着时间的继续增加，黄酮得率开始下降，当提取时间为3.5 h时，黄酮得率下降至3.63 mg/g。提取时间过短，提取不完全，提取效率过低；提取加热时间过长，可能会造成黄酮的氧化，使得黄酮得率降低。因此选择提取时间为2.5 h比较合适。

2.2.2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

乙醇体积分数对黄酮得率的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

由图3可知，在乙醇体积分数40%～60%时，黄酮得率逐渐上升，在60%时到达最大值，其值为5.876 mg/g，随着乙醇体积分数继续增加，黄酮得率有下降的趋势但是并未出现明显差别。可能的原因是乙醇体积分数太低时，无法使得黄酮类化合物有效溶出，对着浓度的增大，溶剂极性增大，黄酮得率增加，但增大到一定浓度时，黄酮得率不再增加，从节省溶剂方面考虑，选择60%的乙醇比较合适。

2.2.3 料液比对黄酮得率的影响

料液比对黄酮得率的影响见图4。

一是只有坚定不移地践行可持续发展治水思路，才能正确把握水利改革发展方向。坚持兴水惠民，努力解决流域人民群众最关切的民生水利问题；坚持人水和谐，以太湖流域水环境综合治理为重点，大力推进水生态文明建设；坚持水资源可持续利用，认真贯彻落实《太湖流域管理条例》，维护河湖健康生命；坚持水利现代化方向，以“智慧太湖”建设为重点，以水利信息化促进水利现代化。

图4 料液比对黄酮得率的影响

由图4可知，料液比为1∶5～1∶15（g/mL）时，黄酮得率逐渐上升，在1∶15（g/mL）时达到最大值，其值为4.957 mg/g，随着料液比的增大，黄酮得率到达平衡，从节约溶剂的角度考虑。选择料液比为1∶15（g/mL）比较合适。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面分析方案与试验结果

按照表1设计进行响应面分析试验，分析方案与试验结果见表2。

表2 响应面分析方案与试验结果

2.3.2 回归方程的建立及显著性分析

根据响应面试验结果，采用ANOVA对表2中的数据进行多元二次回归，得到黄酮得率（Y）与乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、料液比（C）之间的二次多项回归方程：Y=6.20+0.34A-0.016B+0.20C-0.036AB+0.30AC+0.75BC-0.91A2-0.55B2-0.14C2。回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

表3为回归方程的方差分析表，由方差分析结果可知，该回归方程模型极显著（p＜0.01），失拟项p=0.089 1＞0.05，无失拟因素存在。A、BC、A2、B2对黄刺玫果总黄酮得率的影响极显著（p＜0.01），AB、B2对黄刺玫果总黄酮的得率影响显著（p＜0.05），AB和C2对黄刺玫果总黄酮得率的影响不显著（p＞0.05），各因素对黄酮得率的影响依次是A（乙醇体积分数）＞C（料液比）＞B（提取时间）。相关系数R2=0.953 6，变异系数为4.61%，表明该模型有4.61%不能由该模型解释，该试验数据较可靠，该模型拟合度较高，可以用于索氏提取黄刺玫果总黄酮的理论预测。

2.3.3 响应面分析

响应值与各试验因素，及各因素交互作用构成的等高线和响应面见图5～图7，考察乙醇体积分数、提取时间、料液比中任意一个因素水平在零时，其他两个因素的交互作用对黄酮得率的影响。

图5为料液比为1∶15（g/mL）时，乙醇体积分数和提取时间对总黄酮得率的影响。

图5 乙醇体积分数和提取时间对黄酮得率的等高线和响应面图

由图5可以看出，在提取时间一定时，黄酮得率随乙醇体积分数先增大后降低；在乙醇体积分数一定时，黄酮得率随提取时间先增大后略有下降。等高线接近圆形，且响应面坡度小，表明提取时间和乙醇体积分数的交互作用不明显，这与回归方程方差分析的结果相符合。

图6为提取时间为2.5 h时，乙醇体积分数和料液比对总黄酮得率的影响。

图6 乙醇体积分数和料液比对黄酮得率的等高线和响应面图

由图6可以看出，在乙醇体积分数一定时，黄酮得率随料液比先增大后平缓；在料液比一定时，黄酮得率随乙醇体积分数先增大后降低。等高线密集，且接近椭圆形，响应面坡度较陡峭，说明乙醇体积分数和料液比的交互作用显著。

图7为乙醇体积分数为60%时，提取时间和料液比对总黄酮得率的影响。

图7 提取时间和料液比对黄酮得率的等高线和响应面图

由图7可以看出，在提取时间一定时，黄酮得率随着料液比的增大而增大；在料液比一定时，黄酮得率随着提取时间先增大后降低。等高线密集且响应面坡度陡峭，说明提取时间和料液比的交互作用显著。

2.3.4 最佳工艺条件的确定及验证试验

根据所得到的回归模型，预测得到索氏提取黄刺玫果中总黄酮的最佳工艺为乙醇体积分数为69.34%，提取时间为2.82 h，料液比为1∶20（g/mL），此时黄刺玫总黄酮理论得率为6.289 mg/g。结合实际情况最佳工艺修改为乙醇体积分数为70%，提取时间为2.8 h，料液比为1∶20（g/mL），在此条件下进行3次试验验证，结果黄刺玫总黄酮平均得率（6.198± 0.048）mg/g，实际值与理论值6.289 mg/g的误差仅为1.4%，证明该试验模型合理，优化的提取工艺切实可行，适合黄刺玫总黄酮的提取。

3 结论

试验采用索氏提取黄刺玫总黄酮，通过单因素试验，考察乙醇体积分数、提取时间和料液比对黄酮得率的影响，并通过响应面法优化提取工艺。通过回归模型预测到索氏提取黄刺玫总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数为70%，提取时间为2.8 h，料液比为1∶20（g/mL），此时总黄酮得率（6.198±0.048）mg/g，优化得到的工艺合理可行，为黄刺玫总黄酮的充分提取及应用提供了理论依据。