甘蔗对梢腐病菌Fusarium不同病原种的室内离体抗性评价

王伟超，古幸灵，周主贵，刘丽敏，刘红坚，李毅杰，段维兴，雷敬超，黄思良，谭宏伟，刘平武，林善海,,

（1.广西大学农学院，广西 南宁 530004；2.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007；3.广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/农业农村部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530007；4.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南 南阳 473061）

0 引言

甘蔗是我国重要的糖料作物［1］，随着新台糖系列甘蔗品种的引进和推广种植，甘蔗梢腐病在我国发生呈加重趋势，已经成为甘蔗生长过程中的主要病害［2］，严重影响甘蔗的产量与质量。甘蔗梢腐病是由镰刀菌侵染引起的一种真菌性叶部病害［3］，国外现已报道的甘蔗梢腐病病原有7种，分别为F.sacchari、F.verticillioides、F.proliferarum、F.subglutinans、F.andiyazi、F.incarnatum和F.oxysporum［4-7］，但不同国家和蔗区的病原种群及优势种存在差异。马来西亚已报道的种有3个，分别为F.sacchari、F.proliferatum和F.subglutinans，以F.sacchari为主［8-9］。伊朗目前报道有3种，分别为F.verticillioides、F.proliferatum和F.subglutinans，优势种为F.verticillioides［10-11］。南非报道的3个种为F.sacchari、F.proliferatum和F.andiyazi，优势种为F.sacchari［12］。我国已报道甘蔗梢腐病病原有5个种，分别为F.sacchari、F.verticillioides、F.proliferatum、F.andiyazi和F.oxysporum［6,13-15］,Lin等［16］和Meng等［13］的研究结果表明甘蔗镰刀菌（F.sacchari）为国内甘蔗梢腐病菌的优势种。目前国内对甘蔗镰刀菌的研究和报道较少，梢腐病的防治还没有科学有效的解决办法，通过梢腐病不同病原菌致病力进行测定，对筛选高抗种质资源和选育病害高抗优良新品种具有重要的科学意义。

我国对梢腐病的抗性研究不多，主要集中在田间的抗性评价［2，3，17，18］。上个世纪90年代，刘梦林等［3］最早开始对甘蔗梢腐病的抗性展开了一些研究，并初步制定了一些抗性评价标准。林善海研究团队在此基础上建立了甘蔗梢腐病田间抗性评价体系，明确了不同甘蔗种植区域、不同品种（系）以及不同种植时期存在感抗梢腐病差异性［2］。并对广西蔗区主要栽种的13个推广品种进行了田间抗性评价，其中2个中抗梢腐病品种、9个抗梢腐病品种、2个高抗梢腐病品种［18］。李文凤等［19］根据发病株率划分5个等级，并对甘蔗新良种及主栽品种进行自然抗性评价。Wang等［20］对88个甘蔗材料采用注射接种法进行梢腐病抗性鉴定，结果发现GT37和GT21为感梢腐病材料，ROC22和YT94-128为抗梢腐病材料。植物病害的发生除了自身的抗性，还与环境条件、病原种群和密度、栽培措施等因素密切相关，采用人工胁迫接种能最大限度反应植物本身的抗病性。本课题组前期以F. sacchari为接种体，采用室内离体接种方法结合病斑长度，初步建立了室内离体抗性评价方法［21］。本研究在前期基础上拟采用离体叶片接种法，以多种甘蔗梢腐病病原菌为接种体，分析甘蔗对梢腐病菌的抗性，为进一步研究梢腐病菌与甘蔗相互作用奠定基础，并为筛选抗病种质资源、甘蔗新品种选育和推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验甘蔗材料选用ROC22、GT37、LC05-136等3个栽培品种及F134、CP34-120、CP72-1210、CP85-1308、CP89-170和HoCP02-263等6份甘蔗种质材料，其中3个栽培品种ROC22、GT37和LC05-136在广西蔗区生产上对梢腐病的抗性分别表现为抗病、高感和高感（相对GT37稍轻一些）。蔗种剥叶砍种后于2019年4月10日种植在广西农业科学院甘蔗研究所大棚内。利用野生菌株甘蔗镰刀菌（F. sacchari）PB4-21和PB6-3菌株、新知镰刀菌（F. andiyazi）PB3-1菌株、层出镰刀菌（F. proliferatum）NN2菌株以及PB6-3 和PB3-1 的EMS 诱 变 菌 株（MPB6-3 和MPB3-1）共计6份材料作为接种体。

1.2 试验方法

1.2.1 接种体准备

将保存于-80℃的梢腐病菌野生菌株PB3-1、PB6-3、PB4-21、NN2及2个EMS诱变菌株MPB6-3和MPB3-1菌液中吸取20μL菌液于20mL马铃薯葡萄糖水培养基（PDW）中，30℃、220rpm摇菌2d左右，待菌丝长出后进行二次活化，从活化的菌液中吸取20μL滴加到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）表面，采用涂布法，将菌液均匀地涂布在培养皿表面，封口膜封口，于28℃恒温培养箱中倒置培养3d，接种前用打孔器将平板打成9mm的菌饼用于室内离体接种。

1.2.2 室内离体接种

参照孙洁莹等人［22］的离体叶片接种方法，分别于7月8日（分蘖期）和9月23日（伸长期）用菌株进行接种，剪取10份不同甘蔗材料+2～+3叶健康叶片于室内进行针刺接种，每个材料3个重复，每个重复3张叶片。先用75%酒精将甘蔗叶片擦净，将每张叶片剪成13cm左右片段，叶片两端用酒精进行消毒防止伤口感染，在叶脉中间一侧进行针刺处理，将长有菌丝一面的菌饼覆盖在伤口处，每片叶接种1块菌饼，处理好的甘蔗叶片放置于培养皿中，培养皿中放一张湿润滤纸对叶片进行保湿，室温下培养（湿度80%～90%），跟踪观察病斑发展情况。

1.2.3 病情调查和抗性评价

根据前期的研究结果［21］，选择在接种后第7d测量病斑的长度，沿着叶脉方向测量黄色晕圈的长度，根据病斑长度划分梢腐病发病等级和抗性等级，结果见表1。

1.3 数据统计与分析

根据病斑长度，利用Excel 2007对接种发病的数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同菌株致病力测定

测试的3个Fusarium种5个菌株均可引起测试的9份甘蔗材料发病。菌株PB3-1能够较快识别并侵入甘蔗叶引起发病，除了在ROC22和CP72-1210品种上较NN2菌株快外，后期病斑的拓展上相对较其他菌株弱。5个菌株对甘蔗CP85-1308品种致病力较弱，对F134和CP72-1210两个甘蔗品种致病力较强，接种第7d所有的材料病斑直径均超过100mm，结果见表2。

表1 甘蔗梢腐病室内接种发病等级划分标准

2.2 诱变菌株和野生菌株致病力测定

采用F. andiyazi和F. sacchari的两个野生菌株（PB3-1和PB6-3）与诱变菌株（MPB3-1和MPB6-3）对9份甘蔗材料进行致病力比较。结果发现，诱变菌株致病力整体上明显变弱，但在个别甘蔗材料上结果相反，F. andiyazi诱变菌株MPB3-1对甘蔗材料ROC22、HoCP02-263和CP72-1210及F. sacchari诱变菌株MPB6-3对甘蔗材料F134、CP34-120、CP72-1210、LC05-136和CP89-170的致病力均较野生菌株强，结果见表3。说明诱变后，菌株的部分致病力基因发生变异，但菌株的致病力是由多个基因共同作用，且不同甘蔗品种对病原的不同致病基因响应效果不同。

表2 不同甘蔗梢腐病菌对甘蔗种质材料离体接种结果

2.3 不同甘蔗材料对不同菌株抗性评价

供试的9个甘蔗种质材料中，甘蔗品种ROC22对3个Fusarium种4个菌株均表现为感病或高感，感病程度高于生产中的表现，可能由于人工接种与田间的感病机制存在较大差异。GT37对3个Fusarium种均表现为高感，与生产上的表现一致。LC05-136仅对F. sacchari PB6-3菌株表现为高感，但对相同种另外一个菌株PB4-21反而表现为中抗，说明菌株致病力存在较大差异；另外，LC05-136对PB3-1和NN2表现为感病，感病情况与生产上的表现一致。CP85-1308对5个不同菌株抗病性最好，整体抗病性较好，F134和CP72-1210这2个甘蔗品种表现均为高感，整体抗病性较弱，结果见表4。

2.4 不同甘蔗材料对诱变菌株与野生菌株抗性评价

CP34-120和LC05-136分别对PB3-1和诱变菌株MPB3-1的抗性水平表现相同，ROC22、CP72-1210和HoCP02-263对野生菌株PB3-1抗性水平较诱变菌株MPB3-1强，其余4个品种则相反。ROC22和CP72-1210分别对PB6-3和诱变菌株MPB6-3的抗性水 平 也 表 现 相 同，LC05-136、F134、CP34-120 和CP89-170对野生菌株PB6-3的抗性水平较诱变菌株MPB6-3强，其余3个品种则相反，结果见表5。

表3 诱变菌株和野生菌株对人工接种致病力测定

表4 不同甘蔗材料对不同菌株抗性评价

2.5 不同接种时期致病力比较

综合两个甘蔗生长期叶片发病的测定结果，除PB3-1接种CP85-1308伸长期较分蘖期发病情况较重，PB3-1 接 种F134，PB6-3 接 种ROC22、CP85-1308，MPB6-3接种ROC22、CP34-120和CP85-1308发病情况相同外，整体上甘蔗品种伸长期整体接种情况较分蘖期发病较轻，甘蔗病原菌在分蘖期致病力较强，伸长期致病力较弱，结果见表6。

3 讨论

甘蔗品种的抗病性受到区域性气候、生态环境、栽培方式和病原种群等因素的影响，而同一品种对梢腐病不同病原的抗性也不同［20］。本研究结果表明，不同病原菌对甘蔗的致病力存在明显差异。部分菌株实验结果与本实验前期结果不同，可能是由于甘蔗不同生育期导致的差异。整体结果与前人的田间抗性调查结果略有差异，前人［17-18］研究表明，ROC22田间表现为抗病，但在本实验中整体表现为中感或高感，说明其他因素对ROC22的抗病性起到了主导作用。LC05-136田间表现高感，但在本研究中对F. sacchari强致病力PB6-3菌株表现为高感，对弱致病力F. sacchari PB4-21菌株表现为中抗，而对F. proliferatum和F. andiyazi表现为感病，说明田间引起LC05-136梢腐病严重发生时的病原很可能是F. sacchari。GT37在生产中也是高感梢腐病的品种，在本研究结果中，均对3个镰刀菌种表现为高感，说明田间引起GT37梢腐病严重发生的病原很可能是这3个镰刀菌种中其中一个，或者多个符合侵染。PB6-3对LC05-136表现为强致病力菌株，PB4-21表现致病力较弱，但在GT37上的致病力恰好相反，说明不同基因型甘蔗品种对同一个病原菌治病基因的响应不同。CP72-1210在田间表现为中抗［23］，但在本实验中表现均为高感，可能由于不同菌株致病力不同导致，说明不同病原菌对甘蔗的致病力存在明显差异。甘蔗和病原菌在长期的互作进化中会发生变异而丧失抗病性，因此试验筛选出的高抗、中抗材料还应进行长期和大面积的田间种植与调查，才能更系统全面的评价甘蔗品种的抗病性。

表5 不同甘蔗材料对EMS诱变菌株与野生菌株抗性评价

表6 不同生育期甘蔗材料对梢腐病菌的抗性比较

甲基磺酸乙酯（EMS）诱变是最为有效的化学诱变技术方法之一，其能诱发产生高密度的系列等位基因点突变，具有诱变频率高［24］、对材料损伤轻和成本低［25］等特点，被广泛用于植物和微生物诱变育种中。Statler［26］和Teo等人［27］用EMS处理小麦秆锈菌、小麦叶锈菌和燕麦秆锈菌后，获得了毒性不同、颜色变异和冬孢子发育速率不一的不同表型突变体。姚秋燕等人［28］在此基础上研究了EMS诱导小麦条锈菌毒性突变，获得了5个突变菌系，研究证实了小麦条锈病菌毒性突变是其毒性变异的重要途径。本实验采用F. andiyazi和F. sacchari的两个野生菌株与诱变菌株对9份甘蔗材料进行致病力比较。结果发现，诱变菌株致病力整体上明显变弱，但在个别甘蔗材料上结果相反。说明诱变后，菌株的部分致病力基因发生变异，但菌株的致病力是由多个基因共同作用，而且不同甘蔗品种对病原的不同致病基因响应效果不同。

综合两个时期发病的调查结果，9个甘蔗品种伸长期整体发病较分蘖期轻。通过不同生育期接种试验对比可以看出，不同甘蔗材料对梢腐病的抗性不同，甘蔗的不同生长时期抗病性也会发生变化。这可能与叶片的老嫩程度有关，分蘖期的叶片相对伸长期的叶片嫩，叶片纤维化和木质化程度也相对较低，易于病原菌的入侵，另外还可能与矿质营养元素的吸收及细胞结构有关，其抗性差异机制有待深入研究。