HPV16-E6、E7 蛋白在宫颈癌组织中的表达与病理特征的相关性

阮立通，邵志叶，钱钢

宫颈癌（CC）是危害我国女性健康的主要妇科疾病，是第二大恶性肿瘤疾病[1]。近年来，宫颈病变、宫颈癌与人乳头瘤病毒（HPV）感染间存在紧密关联已成为学界共识[1-3]。其中高危型HPV（HRHPV）感染更是宫颈癌的独立危险因素，HPV-16 为感染率较高的HR-HPV亚型，其入侵人体后可导致正常细胞化生，同时其可刺激相关致癌基因生成 HPV16-E6、HPV16-E7 致癌蛋白，引起机体细胞周期调节蛋白（CCRP）功能、表达水平异常，增加感染者宫颈癌变风险。随着医学检测技术及设备的发展，HPV16-E6及E7 蛋白的临床检测成为可能，通过对E6、E7 癌蛋白的表达水平与宫颈疾病间的相关性进行分析总结，以得出科学有效的诊疗、防控方案对临床宫颈疾病患者而言具有重要意义[3]。现阶段关于E6、E7 癌蛋白在宫颈疾病中的作用机制尚不完全明确，本研究探讨HPV16-E6 及E7 蛋白与宫颈病变、宫颈癌的相关性，以期为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年10 月至2020 年 1 月浙江省慈溪市妇幼保健院147 例宫颈疾病患者，根据病理学检查结果，将 56 例 CC 患者设为 A 组，43 例高度鳞状上皮内病变（HSIL）患者设为B组，48 例低度鳞状上皮内病变（LSIL）患者设为C 组。纳入标准：（1）A 组符合FIGO《2018 癌症报告：宫颈癌新分期及诊治指南》[4]中 CC 诊断标准；（2）B、C 组患者符合《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南》[5]中 CIN 诊断标准；（3）均经阴道镜下活检证实；（4）基本生命体征稳定，肢体挪动、5 m 内行走等基本活动无碍；（5）自愿签署知情告知书。排除标准：（1）合并严重心、肝、肾等脏器功能损伤或严重水电解质紊乱、急性感染、机械性损伤、血液系统、内分泌系统疾病，可能对本研究造成干扰者；（2）存在严重意识障碍、情感障碍或精神病史，无法配合基本研究调查者。其中A 组年龄35 ～76 岁，平均（43.4±4.3）岁；体质量指数（BMI）18 ～27 kg/m2，平均（23.16±3.34）kg/m2；FIGO 分期：Ⅰ期 20 例，Ⅱ期 23例，Ⅲ期 13 例；鳞癌 37 例，腺癌 19 例。B组年龄36～75岁，平均（44.2±4.2）岁；BMI 18 ～ 26 kg/m2，平均（23.25±3.28）kg/m2；CIN Ⅱ期 29 例，CIN Ⅲ期 14 例。C组年龄33～76岁，平均（43.6±4.3）岁；BMI 19 ～ 27 kg/m2，平均（23.43±3.35）kg/m2；均为CINⅠ期。本研究经医学伦理委员会批准，3 组一般资料差异无统计学意义（P ＞ 0.05），有可比性。

1.2 方法 检查前3 d 应禁止性生活，检查期间避开经期，采用电子阴道镜，扩阴并充分暴露宫颈后将探头置入受检者阴道内，对子宫颈形态、颜色、有无赘生物等进行详细检查，采集受检者病理组织样本用于相关蛋白测定及病理学检查，本研究以病理学检查结果作为诊断“金标准”。

HPV16-E6 及 E7 蛋白检测：以免疫组化染色法（SP）染色，将病理组织样本制作成石蜡切片，行脱蜡至水操作后于25℃温度下以0.3% 浓度过氧化氢溶液浸泡10 ～15 min，以蒸馏水清洗后进行热抗原修复，而后于磷酸缓冲盐溶液（PBS）中反复清洗3 次，滴加5%浓度牛血清白蛋白（BSA）后于25℃温度下孵育15 min，加入一抗稀释液（Leica Biosystems Newcastle Ltd，500 ml）后于 4℃温度下放置过夜；次日取出组织样本于25℃温度下放置30 min 后以PBS 清洗3 次，加入D-生物素（西宝生物科技，5 g）以标记二抗稀释液（Leica Biosystems Newcastle Ltd，100 ml）后于 37℃温度下孵育30 min，以PBS 清洗 3 次，加入链霉亲和素（陕西新研博美生物科技，5ml）复合体后于37 ℃温度下孵育20 min，以 PBS 清洗 3 次，以 DAB 染色液（上海歌凡生物科技，100 ml）初染，以苏木素染色液（上海歌凡生物科技，100 ml）复染，脱水、透明处理后封片；置于显微镜下观察染色情况并控制反应进度，再次染色、脱水、透明处理后封片。分别以已知CC 病例、PBS 替代一抗做阳性、阴性对照，于光学显微镜下观察细胞核、细胞质呈棕色的细胞数量，染色细胞数＞10%即为阳性。

1.3 观察指标 对比3 组 HPV16-E6、E7 蛋白阳性率；记录A 组临床资料，包括淋巴结转移、肿瘤最大径、临床分期、病理类型、宫旁浸润等病理特征。

1.4 统计方法 采用SPSS 22.0 进行数据分析，计量资料分别平均数±标准差表示，采用t 检验；计数资料采用2检验；相关性分析采用 Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组 HPV16-E6、E7 蛋白阳性率比较 A组HPV16-E6、E7 蛋白阳性率高于B 组、C 组（2≥26.184，均 P ＜ 0.05）；B组HPV16-E6、E7 蛋白阳性率高于C 组（2=23.843/35.707，均P＜ 0.05），见表 1。

2.2 HPV16-E6、E7 蛋白阳性与宫颈癌病理特征的相关性 HPV16-E6、E7 蛋白阳性率与CC 患者年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移、组织学分级间差异无统计学意义（均P＞0.05），与临床分期、宫旁浸润、病理类型间差异有统计学意义（均P ＜ 0.05），见表 2。

2.3 HPV16-E6 阳性与 HPV16-E7 阳性的相关性 CC 患者HPV16-E6 阳性与HPV16-E7 阳性呈正相关（r=0.542，P ＜0.05），见表 3。

3 讨论

CC属于上皮肿瘤，是临床常见的女性恶性肿瘤，发病机制尚未明确，研究证实其或由慢性宫颈炎症、宫颈肿瘤在环境、遗传、病理性因素等多因素作用下发展而来。近年来，越来越多研究[6-7]证实了宫颈病变与HPV 感染间存在关联性，CC 患者中HPV 感染率更是高达90%。由于宫颈病变与HPV 间的密切关联，临床预防宫颈癌等宫颈病变主要以预防HPV 感染为主，虽然目前已有效果良好的HPV 感染预防疫苗，但现阶段HPV疫苗较稀缺且价格较昂贵，难以满足广大女性的接种需求。尽管疫苗防治在短期内难以实现，但随着基因诊断技术与设备的不断进步，方便快捷的HPV 基因检测已逐渐应用于各大医院，有助于临床对CC、宫颈病变与HPV 感染间的关联性作进一步研究。HPV16 是临床感染率较高的HR-HPV 亚型之一，当HPV16侵入人体后可激活、刺激HPV16E6 等相关癌基因合成E6、E7 致癌蛋白，HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白可与 CCRP 特异性结合进而影响人体细胞调节周期异常，使细胞分化增殖、分化进程发生变化，进而增加女性感染者CC 发生概率。

表13 组 HPV16-E6、E7 蛋白阳性率对比 例（%）

CC 患者卵巢功能遭到损害时垂体会反馈性的分泌促卵泡激素（FSH），在FSH 与 HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白的多重作用下，患者机体内多种细胞因子的表达水平结皆可出现异常[8]。如HPV16-E6蛋白可促进血管内皮生长因子（VEGF）的分泌合成，VEGF 可诱导血管新生，促进血管内皮细胞分化、增生及浸润，进而增加CC 患者癌细胞增殖、转移风险。本研究中CC患者HPV16-E6、E7 蛋白阳性率高于 HSIL、LSIL 患者，而 HSIL 患者HPV16-E6、E7 蛋白阳性率高于 LSIL 患者，与岳晚侠等[9]结果对应。表明HPV16-E6、E7 蛋白阳性或与患者宫颈病变程度有关，患者宫颈病变程度越高、宫颈损伤越严重则组织中HPV16-E6、E7 蛋白表达水平越高，这或是由于HPV16-E7 蛋白可影响人体关键抑癌基因-P53 基因的信号转录，进而使其对细胞增殖的抑制功能减弱，随着患者宫颈病变程度的提高，P53 基因的抑癌功能则逐渐丧失，进而引发CC。本研究结果中HPV16-E6、E7 蛋白阳性率与临床分期、宫旁浸润、病理类型间差异有统计学意义，也佐证了这一观点。本研究还显示，CC 患者HPV16-E6 阳性与 HPV16-E7 阳性呈正相关，这表明 HPV16-E6、HPV16-E7 蛋白表达可相互促进。这可能是由于 H PV16-E6 蛋白可增加外源性DNA 整合、诱变进程及风险，还可引起端粒酶逆转录酶（TERT）的mRNA 水平上升，导致机体内正常细胞永生化，影响细胞周期调节；而HPV16-E7 蛋白22 ～226 位氨基酸为人体重要细胞周期调节因子-成视网膜母细胞瘤蛋白（PRB）的结合位点，在HPV16-E7 蛋白作用下可使细胞周期调控异常。

表3 CC 患者HPV16-E6 阳性与HPV16-E7 阳性的相关性