大别山红天麻饮片多指标质量标志物研究△

耿文洁，汪聪聪，刘劲松，桂双英，彭代银，王举涛，2*

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012

天麻为兰科天麻属寄生植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎，是我国沿用已有一千多年历史的传统滋补名贵中药材之一，且可药食两用[1]。天麻性平，味甘，归肝经，具有息风止痉、祛风通络、平抑肝阳等功效[2]，主要用于肝风内动、惊痫抽搐、眩晕、头痛及中风手足不遂、风湿痹痛等证。我国天麻可分为5种变型：红天麻、绿天麻、乌天麻、松天麻和黄天麻[3]。安徽大别山地区主产红天麻，其为天麻的原变型，具有很高的研究价值。

质量标志物主要依据中药属性、制造过程及配伍理论等特点提出，是中药及中药复方质量评价的指标性成分[4-5]。以1～2种活性成分或指标成分进行定性定量分析的质量评价模式已经不能满足中药质量评价的要求，多指标综合质量评价模式已成为中药质量评价的新需求，也是新的研究趋势[6-8]。本研究通过一测多评(QAMS)研究大别山红天麻质量标志物及特征图谱，为其质量标准的建立提供参考。

1 材料

1.1 仪器

DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯设备厂)；AUW220D型分析天平、LC-10AD型日本岛津高效液相色谱仪(Shimadzu)；HH-6型数显恒温水浴锅(金坛市朗博仪器制造有限公司)；AnkeTGL-16G型离心机(上海安亭仪器科学仪器厂)；KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Thermo UltiMate 3000型高效液相色谱仪；Waters1525型高效液相色谱仪。

1.2 试药

对照品天麻素(批号：DST180411-013)、腺苷(批号：DST181110-047)、5-羟甲基糠醛(批号：DST180709-056)、对羟基苯甲醇(批号：DST181216-123)、对羟基苯甲醛(批号：DST190512-129)、巴利森苷A(批号：DST180419-102)、巴利森苷E(批号：DST190214-066)纯度≥98%；对照品巴利森苷B(批号：DST190214-063)、巴利森苷C(批号：DST190214-064)纯度≥97%；对照品对羟基苯甲酸(批号：DST180506-114，纯度≥99%)，以上对照品均购自成都德斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸均为色谱纯；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

从大别山地区分别收集10批红天麻饮片，经安徽中医药大学杨青山副教授鉴定为兰科天麻属植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎。留样均保存于安徽中医药大学天然药物化学实验室。样品信息见表1。

表1 10批红天麻饮片产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～21 min，3%～5%A；21～42 min，5%～14%A；42～56 min，14%A；56～60 min，14%～20%A；60～65 min，20%～34%A；65～78 min，34%～95%A；78～83 min，95%～3%A；83～90 min，3%A)；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。理论塔板数按天麻素峰计算应不低于5000。在此条件下，9种质量标志物与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品(批号：201812001Y)；1.腺苷；2.天麻素；3.对羟基苯甲醇；4.对羟基苯甲酸；5.对羟基苯甲醛；6.巴利森苷 E；7.巴利森苷 B；8.巴利森苷 C；9.巴利森苷 A；图2同。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷 A、巴利森苷 B、巴利森苷 C、巴利森苷 E 对照品各适量，加30%乙腈，制成质量浓度分别为0.127 0、0.180 6、0.017 5、0.001 5、0.000 9、0.238 0、0.135 0、0.047 0、0.113 2 mg·mL-1的混合对照品溶液，摇匀，于冰箱中避光保存，备用，滤过，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取红天麻饮片粉末(过三号筛)约0.4 g，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，精密加入3%乙腈25 mL，称定质量；置于85 ℃的水浴锅中，回流0.5 h，放冷，补足减失的质量，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系考察 精密吸取2.2项下混合对照品储备液2、4、6、8、10、12 μL注入液相色谱仪。以各对照品的质量为横坐标，相应的峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，见表2。结果表明，9种质量标志物成分在相应范围内线性关系良好。

表2 大别山红天麻饮片线性关系标准曲线

2.4.2精密度试验 精密吸取同一供试品(批号：201812001Y)溶液10 μL，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录各组分色谱峰面积。结果表明，腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷 C、巴利森苷 E的峰面积 RSD分别为1.26%、1.44%、0.59%、0.91%、0.73%、0.22%、0.21%、0.83%、0.35%，结果RSD均小于2%，表明仪器的精密度较好。

2.4.3稳定性试验 取同一供试品(批号：201812001Y)溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、24 h 进样 10 μL，测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E峰面积的RSD分别为1.21%、1.56%、0.55%、1.06%、1.06%、0.28%、0.32%、0.58%、0.22%，结果RSD均小于2%，说明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.4.4重复性试验 精密称取同批次大别山红天麻饮片(批号：201812001Y)粉末(过三号筛)约0.4 g，按2.3项下供试品溶液的制备，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进样测定。结果表明，腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E的质量分数RSD分别为1.05%、1.23%、0.46%、1.29%、1.54%、0.73%、0.68%、0.48%、0.58%，结果RSD均小于2%，表明重复性良好。

2.4.5加样回收率试验 精密称取已测定的大别山红天麻饮片粉末(过三号筛)约0.2 g，加入一定量的混合对照品溶液，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进样测定。结果表明，腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、巴利森苷 A、巴利森苷 B、巴利森苷 C、巴利森苷 E的平均加样回收率分别为98.33%、101.85%、101.06%、98.59%、97.46%、96.86%、100.74%、102.21%、99.02%，RSD分别为1.57%、1.10%、1.49%、1.67%、1.54%、1.31%、1.49%、1.23%、1.61%。

2.5 QAMS含量测定

2.5.1相对校正因子的计算 以天麻素为内标，按公式(1)计算其他8种成分的相对校正因子，结果见表3。

表3 腺苷等8种成分相对校正因子

fk/m=fk/fm=(Ck×Am)/(Cm/Ak)

(1)

式中f代表相对校正因子，k代表内标物，m代表其他组分，Ck为内标物质量浓度，Ak为内标物峰面积，Cm为其他组分的质量浓度，Am为其他组分的峰面积。

2.5.2相对校正因子的耐用性考察

2.5.2.1不同仪器对f的影响 考察Waters、Thermo、岛津3个品牌的高效液相色谱仪对f的影响，结果见表4。

表4 不同仪器对红天麻饮片中8种成分相对校正因子的影响

2.5.2.2不同色谱柱对f的影响 考察Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱对f的影响，结果见表5。结果表明，f对不同品牌色谱柱具有良好的适应性。

表5 不同色谱柱对红天麻饮片中8种成分相对校正因子的影响

2.5.310批次样品含量测定结果 取10批大别山区产红天麻样品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，测定其9 种质量标志物成分的含量，结果见表6。10 批样品中各成分质量分数分别为腺苷22.347～26.557 mg·g-1、天麻素8.080～10.320 mg·g-1、对羟基苯甲醇4.629～8.301 mg·g-1、对羟基苯甲酸0.638～1.627 mg·g-1、对羟基苯甲醛3.298～6.633 mg·g-1、巴利森苷E 13.594～19.905 mg·g-1、巴利森苷B 18.029～24.480 mg·g-1、巴利森苷C 4.942～6.921 mg·g-1、巴利森苷A 25.939～31.147 mg·g-1。

表6 10 批红天麻饮片样品中9 种质量标志物含量测定结果(n=3) mg·g-1

2.6 特征图谱

2.6.1共有峰的确定 分别取10批大别山红天麻样品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，生成大别山红天麻全谱峰匹配图，经与对照品比对，指认了 10个共有峰，1号峰(4.34 min)为腺苷，2号峰(7.63 min)为天麻素，3号峰(9.967 min)为5-羟甲基糠醛，4号峰(12.62 min)为对羟基苯甲醇，5号峰(23.25 min)为对羟基苯甲酸，6号峰(30.75 min)为对羟基苯甲醛，7号峰(31.96 min)为巴利森苷E，8号峰(44.52 min)为巴利森苷B，9号峰(47.45 min)为巴利森苷C，10号峰(60.39 min)为巴利森苷A。各共有峰相对保留时间的RSD 均小于2%，相对峰面积RSD 存在一定的差异。

2.6.2特征图谱相似度评价 取10 批大别山红天麻样品，按2.3项下方法制备样品溶液，并按2.1项下色谱条件依次进样测定。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”进行指纹图谱分析，采用多点校正后进行自动匹配(时间窗为0.1 min)，用中位数法生成指纹图谱，结果见图 2～3。10批大别山红天麻样品色谱图与对照图谱相似度分别为0.999、0.989、0.999、0.992、0.995、0.988、0.988、0.989、0.993、0.999。

图2 10批大别山红天麻特征图谱匹配图

注：1.腺苷；2.天麻素；3.5-羟甲基糠醛；4.对羟基苯甲醇；5.对羟基苯甲酸；6.对羟基苯甲醛；7.巴利森苷 E；8.巴利森苷 B；9.巴利森苷 C；10.巴利森苷 A。

3 讨论

3.1 提取方式考察

分别用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、3%乙腈超声处理，结果表明，使用流动相3%乙腈直接超声处理提取效率最高，故选择3%乙腈作为提取溶剂。对比用流动相3%乙腈回流和超声提取的样品，确立加热回流作为其提取方式，特征峰信息丰富。

3.2 色谱条件选择

采用DAD检测器在190～400 nm对混合对照品溶液进行扫描，结果 9个成分在270 nm处均有较大吸收，确定测定波长为270 nm。再分别对甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液的流动相体系进行考察，结果显示，乙腈-0.2%磷酸溶液系统色谱峰响应最好、分离度高、基线平稳，故最终确定流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液。同时，还对流速、柱温进行了考察，分别考察了柱温20、25、30、35 ℃，以及流速0.8、1.0、1.2 mL·min-1下的分离效果，结果显示，在柱温30 ℃、流速1.0 mL·min-1条件下色谱峰分离效果最优，故选择在此条件下进行实验。

4 展望

本研究建立天麻素与对羟基苯甲醇类及巴利森苷类成分等多指标质量标志物评价模式，选用性质稳定、价格低廉的天麻素为内标物，建立大别山红天麻中9个质量标志物的QAMS，同时建立了特征图谱，指认了其中10个色谱峰，为今后大别山红天麻的质量控制提供参考。实验过程中发现，天麻素与对羟基苯甲醇类及巴利森苷类成分有相互转化的趋势，有待进一步实验研究。