痰标本荧光定量聚合酶链反应法结核杆菌检测在肺结核患者诊断中的应用

河南省洛阳市疾病预防控制中心（471023）赵卫 刘萌萌

肺结核为结核分枝杆菌感染所致常见慢性病，近年来其发病率持续增高，对患者身心健康及生活质量影响极大，同时，我国为结核病多发国家之一，及早确诊肺结核并有针对性给予对应干预措施有利于改善疾病整体疗效与预后效果。此外，由于免疫抑制剂广泛应用、基础病变及多重耐药等可造成结核病再现，故临床急需加强结核杆菌早期迅速检测，避免延误患者最佳治疗时机。既往临床用于肺结核结核杆菌的病原学检测方式主要包括培养法及痰涂片法，前者为疾病诊断金标准，但用时较长、操作繁琐，而痰涂片法特异性及检出率均较低[1]。FQ-PCR也是肺结核重要诊断措施，其具有较高特异性及敏感度，可检测出1～100fg纯化结核分枝杆菌DNA，逐渐在疾病诊疗中发挥重要作用[2]。基于此，本研究选取肺结核患者103例，探讨FQ-PCR应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我中心2 0 1 7 年6月～2018年12月肺结核患者103例设为研究组，同期103例非肺结核患者设为对照组。研究组男61例，女42例；年龄46～68岁，平均（57.06±5.03）岁。对照组男59例，女44例；年龄47～70岁，平均（57.64±4.91）岁；疾病类型：气胸2例，脓胸3例，支气管扩张症22例，真菌性肺炎4例，细菌性肺炎72例。两组基线资料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 选取标准

1.2.1 纳入标准 ①首次发病；②均经病理检查确诊；③知晓本研究，签署同意书；④研究组经CT或胸片检查可见肺结核征象。

1.2.2 排除标准 ①合并全身性重度感染性病变者；②合并其他肺部病变者；③合并肾肝等脏器器质性病变者；④合并免疫系统、血液系统病变者；⑤合并代谢系统病变者。

1.3 方法 漂浮集菌涂片法：采集患者24h痰液（即时痰、晨痰、晚痰），置于2倍体积无菌蒸馏水内，常规实施20min高压蒸汽灭菌，置入0.3ml二甲苯，震荡约10min后加满无菌蒸馏水，15min静置，取带有血清玻片覆盖于瓶口后静置约15min，去掉载玻片，干燥处理，实施萋-尼氏抗酸染色及镜检分级。FQ-PCR法：取痰标本，置入等量胰蛋白酶（浓度：1%），混合均匀，取0.5ml离心（10000r/min，5min）处理，留沉淀置入生理盐水1ml实施重悬，2次离心洗涤；DNA扩增模板制备：沉淀加入试剂盒DNA，取50ul混合均匀，煮沸约10min后静置裂解菌体6h，离心（10000r/min，5min）处理，取2ul上清液作模板，依据试剂盒说明书所提供反应条件实施DNA扩增，93℃条件下2min预变性，55℃条件下45s、93℃条件下45s，扩增10个循环，随后采取55℃ 45s及93℃ 45s扩增30个循环，取阳性及阴性质控品作参照，若拷贝数＞50则评定为阳性。

1.4 观察指标 ①漂浮集菌涂片法及FQPCR法对肺结核检查结果。②漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法对肺结核诊断效能。

1.5 统计学方法 通过SPSS25.0对数据进行分析，计数资料采取n（%）表示，χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法检查结果 经FQ-PCR法检查可知研究组阳性率为（98.06%）、对照组阴性率为（97.09%），经漂浮集菌涂片法检查可知研究组阳性率为（88.35%）、对照组阴性率为（98.06%）。见附表1。

2.2 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法诊断效能 FQ-PCR法对肺结核诊断敏感度（98.06%）、准确度（97.57%）高于漂浮集菌涂片法（88.35%、93.20%）（P＜0.05），FQ-PCR法对肺结核诊断特异度（97.09%）与漂浮集菌涂片法（98.06%）间无显著差异（P＞0.05）。见附表2。

附表1 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法检查结果[n(%)]

附表2 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法诊断效能(n=206)

3 讨论

抗结核治疗存在不规范性，导致患者机体中结核杆菌对抗结核药物出现耐药，并形成耐多药结核病或耐药结核病。因此，如何早期诊断肺结核并进行针对性治疗仍是研究热点。肺结核常规诊断中，肺泡灌洗液、痰液、浆膜腔积液检测为最可靠诊断措施，结核分枝杆菌细胞壁中存在较多脂类，其不易着色，但延长染色时间并加温处理后，则较难被酸性脱色剂脱色，故临床依据此原理常采取痰涂片法对疑似肺结核患者实施诊断鉴别。痰涂片检查虽具有操作简单等优势，但检查结果极易受操作者主观因素及含菌量低等因素影响；痰培养法则由于结核杆菌特殊细胞壁结构导致生长速度较慢，常规L-J培养用时较长，而快速培养系统（包括BACT/ALERT 3D及Bactec MGIT 960等快速培养系统）虽然可以显著提升检测速度及检出率，但其对痰涂片阳性标本培养用时仍可达7～10d，无法实现肺结核患者早期快速诊断及治疗[3][4]。X线胸片在肺结核诊断中也较常用，但其极易对非典型病例造成漏诊及误诊，诊断效能较低，多需联合实验室检查进行综合诊断。

FQ-PCR法为近十几年得到发展应用的核酸扩增新技术，具备可定量、结果客观、自动化、重复性好、特异度及敏感度高、检测迅速等优势，且相较于常规PCR检查，其具备一定抗污染性，较适用于无法或较难进行人工培养的病原体测定。相关研究表明，FQ-PCR把荧光反应物置入普通PCR反应体系，以此使其和PCR扩增产物间发生关联性，通过测定PCR扩增反应内荧光强度改变定量分析标本内DNA特定序列，相较于普通PCR反应，FQ-PCR法整个反应均于单一管中进行，可最大程度地避免样本遭受污染，保证诊断的有效性[5]。本研究结果显示，FQ-PCR法对肺结核诊断敏感度、准确度高于漂浮集菌涂片法（P＜0.05），表明采取FQ-PCR法对肺结核实施诊断，可显著提升诊断敏感度及准确度，最大程度降低漏诊风险，避免延误患者最佳干预时机。

综上所述，FQ-PCR法在肺结核诊断中具有较高应用价值，可有效检出结核杆菌，提高肺结核诊断准确度及敏感度，避免漏诊，为临床及早制定、调整有针对性干预方案提供客观参考依据。