草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT2.4基因序列的克隆及表达分析

陈 阳，金一锋，金忠民，王玉书，蔡荣建，邵竹林，王 杰

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

氮素是影响草坪生长及观赏价值的重要因素，如何提高氮素利用率是草坪领域急需解决的重点。硝态氮是植物生长发育的主要氮素来源，硝酸盐转运蛋白主要作用于吸收硝态氮，调节氮素的吸收、同化与再利用[1]。植物硝酸盐转运系统主要涉及3个不同的基因家族，包括硝酸盐转运体NRT2s、硝酸盐转运体/肽转运体NRT1/PTR FAMILY、硝酸盐同化相关基因NAR2s[2]。高亲和性硝酸盐转运蛋白主要由NRT2家族编码，在外源硝态氮浓度较低时发挥作用。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativaL.)的研究中发现，部分高亲和硝酸盐运输蛋白NRT2需要与NARs(Nitrate assimilation related genes)共同完成运输硝酸盐的过程[3]，AtNRT2.1和AtNAR2.3有互作，OsNAR2.1与OsNRT2.1、OsNRT2.2硝酸盐转运体相互作用，在不同浓度氮素条件下均起作用[4-5]。

研究发现，NRT2家族基因从氮库通过韧皮部向新生组织或者器官运输过程中发挥一定作用，拟南芥韧皮部负载2种硝酸盐转运蛋白AtNRT2.4和AtNRT2.5，qRT-PCR发现氮素充足时AtNRT2.4主要表达于叶主脉的韧皮部或韧皮部薄壁组织中，当氮饥饿时拟南芥可以从质外体中重新吸收硝酸盐，使氮素向筛管成分和伴生细胞中移动[6]。AtNRT2.5在拟南芥的叶部中表达，其细胞定位尚不清楚，可与AtNRT2.4协同作用于韧皮部的硝酸盐运输过程[6]。禾本科草种NRT2家族基因的相关研究，主要集中于二穗短柄草BdNRT2家族基因，Wang等[7]对多个二穗短柄草(Brachypodium distachyon)NRT2家族基因进行鉴定，发现氮源及氮素浓度均影响BdNRT2家族基因的表达水平。克隆并鉴定草地早熟禾NRT2家族基因的功能，利于了解草地早熟禾硝酸盐转运机制。本研究以草地早熟禾为材料，克隆硝酸盐转运蛋白NRT2.4基因，并进行理化性质、结构域、同源进化关系等生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR进行NRT2.4基因组织特异性及氮素诱导下的表达机制，为后续其功能验证奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为草地早熟禾午夜2号品种，将材料放于光照培养箱中，参数设置为：温度为24 ℃/15 ℃(昼/夜)，光照时长为13 h/11 h(昼/夜)，光照强度500 μmol/(m2·s)，相对湿度60%。本研究选取培养3个月以上的健康植株进行后续试验。

1.2 草地早熟禾RNA的提取与cDNA的合成

选取健康草地早熟禾植株，利用天根植物总RNA的提取试剂盒提取植物总RNA。采用微量分光光度计Nanodrop 测定RNA浓度与纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳观察RNA完整性，待RNA合格后置于-80 ℃保存。以植物总RNA为模板，利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA第1条链的合成，具体步骤参照相关试剂盒，完成后将其放于-80 ℃长期保存。

1.3 草地早熟禾NRT2.4基因编码区的克隆

根据NCBI GenBank已公布二穗短柄草NRT2.4(XM_003566718.4)及本研究前期二代转录组测序得到的草地早熟禾mRNA序列为基础，设计特异性引物，NRT2.4-F: 5′-TTGGCTAGCTACTACCAGCCT AG-3′，NRT2.4-R: 5′-CCAACACACTTCCATATGTAG GAAGT-3′，以草地早熟禾cDNA为模板RT-PCR扩增获得NRT2.4基因ORF序列。

1.4 草地早熟禾NRT2.4基因生物信息学分析

利用ProtParam 在线分析草地早熟禾NRT2.4氨基酸理化性质；利用TMHmmol/LServer 在线分析编码氨基酸的跨膜区；利用SignalP 4.1 分析信号肽情况；利用NetPhos 3.1 Server 在线分析磷酸化位点；草地早熟禾NRT2.4蛋白二级结构利用SOPMA 在线分析，三级结构利用SWISS-MODE在线分析；利用CDD预测草地早熟禾NRT2.4编码氨基酸的典型结构域，相关蛋白的保守基序分析使用MEME (http://meme.sdsc.edu)进行。

1.5 实时荧光定量PCR分析

选取长势一致的植株，将其根部置于1/2 Hoagland水培液中，待培养14 d后进行氮素处理。将植株置于相同氮素浓度不同氮源 (A: NaNO3,B:(NH4)2SO4,C: NH4NO3)培养液，14 d后取样。以NaNO3为氮源配置不同浓度(0，1.5，7.5，15.0 mmol/L)培养液，14 d后取样。以上氮素水培处理植物的取材部位均为叶部，每个处理 3 次生物学重复。采用qRT-PCR的相对定量方法，根据克隆获得NRT2.4基因序列设计引物，Q-NRT2.4-F：5′-ATGGGCCCC GTTTGCGACC-3′，Q-NRT2.4-R：5′-CGGGACATCCA GTGCTGGTT-3′，利用2-ΔΔCt法处理相关数据。

2 结果与分析

2.1 草地早熟禾NRT2.4基因编码区的获得

利用特异性引物NRT2.4-F/NRT2.4-R，通过RT-PCR扩增出条带(图1)，经NCBI分析表明，克隆获得草地早熟禾NRT2.4基因1 694 bp，其中1 257 bp为开放阅读框(ORF)，编码418个氨基酸序列(图2)。

2.2 草地早熟禾NRT2.4基因的生物信息学分析

2.2.1NRT2.4基因编码氨基酸序列分析 用ProtParam对草地早熟禾NRT2.4蛋白的理化性质分析，结果显示：其分子量为43.75 ku，等电点(pI)为8.87，蛋白质分子式为C1977H3089N533O529S30，为稳定蛋白。NRT2.4编码氨基酸组成见表1，其中含量较高的是Ala，占17.9%。其中，表面带负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)有23个，带正电荷的氨基酸残基 (Arg+Lys)有32个，平均亲水系数为0.609。

表1 草地早熟禾NRT2.4编码氨基酸组成Tab.1 The amino acid composition of NRT2.4 in Kentucky bluegrass %

利用TMHmmol/L Server v. 2.0在线分析(图3)，发现草地早熟禾NRT2.4蛋白具有8个跨膜区。由图4可见，草地早熟禾NRT2.4编码氨基酸的平均信号肽最大值为0.131，未超过其阈值0.5，推断出该蛋白无信号肽。利用Expasy-protscale软件分析，该蛋白属于亲水性蛋白(图5)。由图6可见，草地早熟禾NRT2.4蛋白序列潜在的磷酸化位点包括Serine(17个)、Threonine(9个)、Tyrosine(1个)。

2.2.2 草地早熟禾NRT2.4蛋白的二、三级结构预测 经SOPMA对NRT2.4蛋白进行二级结构预测，如图7所示，草地早熟禾NRT2.4蛋白其含有51.67%的α-螺旋、28.71%的不规则卷曲、14.11%的延伸链和5.50%的β-转角 (图7)。进一步利用SWISS-MODEL在线软件对NRT2.4基因编码蛋白三级结构进行建模(图8)，三级结构与NRT2.4蛋白的二级结构预测结果相似。

2.3 NRT2.4基因在不同组织部位及氮素处理中的表达特异性分析

2.3.1 草地早熟禾NRT2.4基因组织表达模式 本研究利用qRT-PCR方法测定草地早熟禾NRT2.4基因在不同组织中相对表达量，如图12-A可见，叶部NRT2.4相对表达量显著高于根部和茎部，NRT2.4基因表达水平存在组织特异性。

3 讨论与结论

植物NRT2家族成员主要参与以硝酸盐为底物进行吸收与转运过程[8-9]。二穗短柄草、拟南芥NRT2家族基因组织特异性相关研究发现，二穗短柄草NRT2家族基因在不同组织中的表达水平存在一定差异，BdNRT2.3和BdNRT2.4基因在叶部高度表达，BdNRT2.5基因在小穗中高度表达，而BdNRT2.6在二穗短柄草不同组织中表达量均较低[10]。拟南芥AtNRT2家族基因在叶部的表达存在一定差异，AtNRT2.4和AtNRT2.5在叶部高度表达，但AtNRT2.6和AtNRT2.7表达量较低[11-12]。甘蓝型油菜(Brassica napusL.)高亲和力硝酸盐转运蛋白NRT2家族基因分析及其对逆境的响应研究发现，BnNRT2.1、BnNRT2.2a和BnNRT2.4a在根组织中表达量较高，而BnNRT2.7a和BnNRT2.7b主要在地上部分表达[13]。可见，同物种不同NRT2家族基因在组织中的表达水平存在一定差异。本研究中草地早熟禾NRT2.4基因在叶部表达量最高，其组织特异性趋势与二穗短柄草BdNRT2.4表达趋势相似。这可能是草地早熟禾与二穗短柄草均为禾本科草种，其特点是地上生长量致密，叶部占整个植株比重较大，所以叶部参与硝酸盐转运过程的BdNRT2.4可能起重要作用。

本研究克隆获得草地早熟禾硝酸盐转运蛋白NRT2.4基因，开放阅读框序列为1 257 bp，编码了418个氨基酸序列，含有Nitrate transmembrane transporter和Nitrite extursion protein结构域，属于Nitrate/nitrite transporter NarK超级家族，与二穗短柄草、节节麦的NRT2.4氨基酸序列同源性最高。草地早熟禾NRT2.4基因在叶部表达量较高，氮饥饿和高浓度NaNO3水培液处理均利于NRT2.4基因的表达。草地早熟禾NRT2.4基因克隆与表达分析有利于进一步验证硝酸盐转运蛋白NRT2家族基因的功能。