儿童哮喘持续状态和间质性肺疾病的相关性

易绘 梁亚勇 肖奕青 蒋卡丽

【摘要】 目的：研究儿童哮喘持续状态和间质性肺疾病（ILD）的相关性。方法：选取2015年10月-2017年10月本院收治的20例儿童哮喘持续状态合并ILD患儿（A组），20例单纯哮喘持续状态患儿（B组），20例单纯ILD患儿（C组）和于本院体检的20例健康儿童（D组）。采用流式细胞术检测四组外周血Th1/Th2，ELISA法检测四组外周血hs-CRP、IL-7样细胞因子（TSLP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及抗Jo-1抗体水平。结果：A、B组Th1和Th1/Th2均明显低于C、D组，且Th2均高于C、D组（P<0.05）。A组Th1和Th1/Th2均明显低于B组，且Th2明显高于B组（P<0.05）。C组Th1和Th1/Th2均明显高于D组，且Th2明显低于D组（P<0.05）。A、B、C组hs-CRP和TSLP水平均高于D组，其中A组>B组>C组（P<0.05）。A、B、C组MCP-1与抗Jo-1抗体均高于D组，其中A组>C组>B组（P<0.05）。结论：儿童哮喘持续状态和ILD关系密切，Th1/Th2平衡调节可能是两者关联的重要机制，可作为两种疾病的内在机制和治疗靶点研究的参考依据。

【关键词】 哮喘持续状态 间质性肺疾病 Th1/Th2 hs-CRP IL-7样细胞因子 单核细胞趋化蛋白-1 抗Jo-1抗體

[Abstract] Objective： To study the correlation between status asthmaticus and interstitial lung disease （ILD） in children. Method： A total of 20 children with status asthmaticus combined with ILD （group A）， 20 children with status asthmaticus alone （group B）， 20 children with ILD alone （group C） and 20 healthy children （group D） admitted to our hospital from October 2015 to October 2017 were selected. The levels of Th1/Th2 in peripheral blood of the four groups were detected by flow cytometry， and the levels of hs-CRP， IL-7-like cytokines （TSLP）， monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1） and anti-Jo-1 antibody in peripheral blood of the four groups were detected by ELISA. Result： Th1 and Th1/Th2 in groups A and B were significantly lower than those in groups C and D， and Th2 was higher than those in groups C and D （P<0.05）. Th1 and Th1/Th2 in group A were significantly lower than those in group B， and Th2 was significantly higher than that in group B （P<0.05）. The Th1 and Th1/Th2 in group C were significantly higher than those in group D， and the Th2 in group C was significantly lower than that in group D （P<0.05）. The levels of hs-CRP and TSLP in groups A， B and C were higher than those in group D， among which group A > group B > group C （P<0.05）. MCP-1 and anti-Jo-1 antibodies in groups A， B and C were higher than those in group D， among which group A > group C > group B （P<0.05）. Conclusion： The children with status asthmaticus is closely related to ILD， and the regulation of Th1/Th2 balance may be an important mechanism of the association between the two diseases， which can be used as a reference for the study of the internal mechanisms and therapeutic targets of the two diseases.

[Key words] Status asthmaticus Interstitial lung disease Th1/Th2 hs-CRP IL-7 like cytokine Monocyte chemoat-tractant protein-1 Anti-Jo-1 antibody

研究认为，儿童哮喘是Th1/Th2平衡失衡，Th2炎症占优势的气道炎症[1]。IL-7样细胞因子（TSLP）在哮喘的发生和发展中起重要作用，可通过上调Th2细胞表达，使Th1/Th2平衡向Th2倾斜[2]。哮喘持续状态是较严重的哮喘形式，是外界环境（粉尘或屋尘螨）与自身免疫系统紊乱共同参与的结果[3]。据统计，儿童哮喘持续状态并发间质性肺疾病（ILD）的发生率逐渐增加，我国每年新诊断儿童哮喘（200～350）万，其中3%～10%可并发ILD[4]。ILD是以弥漫性渗出和气体交换障碍为特点的慢性肺疾病，发病机制较为复杂，但多数学者认为，自身免疫功能障碍导致肺部损伤起重要作用[5]。目前关于儿童哮喘持续状态与ILD的相关研究还较少，基于此，本研究通过分析有关的免疫活性细胞或因子的表达水平，解释可能的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年10月-2017年10月本院收治的20例儿童哮喘持续状态合并ILD患儿（A组），20例单纯哮喘持续状态患儿（B组），20例单纯ILD患儿（C组）和于本院体检的20例健康儿童（D组）。诊断标准：儿童哮喘诊断参照全球哮喘防治倡议（GINA）标准;ILD诊断参照2002年美国胸科学会（ATS）和欧洲呼吸学会（ERS）的临床、病理和放射学标准。纳入标准：年龄5～14岁;符合上述诊断标准。排除标准：先天发育异常、遗传代谢性疾病;明显病因的ILD;其他类型的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮。所有患儿家属均知情同意并签署知情同意书，本研究已经医院伦理委员会批准。

1.2 方法 采用流式细胞术检测各组外周血Th1/Th2。流式细胞术主要试剂和仪器：淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制剂有限公司），Anti-Human IL-4 PE、Anti-Human y-IFN PE、Anti-Human CD4 FITC（eBioscience，San Diego，CA）。流式細胞仪（美国Beckman Coulter有限公司）。（1）标本采集：清晨空腹采集肘静脉血5 mL，2 h内2 000 r/min离心10 min，取上清-20 ℃保存待检细胞因子。余血液采用密度梯度离心法2 000 r/min离心20 min，分离外周血单个核细胞（PBMC），8 h内上机做流式细胞检测Th1/Th2。（2）PBMC分离：利用淋巴细胞分离液分层后，中间白色云雾状为PBMC。（3）PBMC铺板和活化：显微镜下调整浓度为2×106/mL，依次加入新鲜配制的佛波酯（PMA，50 ng/mL），离子霉素（2 μg/mL），布雷菲得菌素（BFA，3 μg/mL），取悬液至24孔细胞培养板内，37℃ 5%CO2培养箱中孵育5 h。（4）Th1和Th2细胞表面和胞内抗体标记：取2个1.5 mL流式管重悬，标记为A和B，A为实验管，B为对照组管。加1 mL PBS、1 500 r/min离心5 min、弃上清;分别加入抗人CD4-FITC 5 μL，对细胞膜表面CD4分子进行特异性染色，室温避光孵育30 min;加1 mL PBS、1 500 r/min离心5 min、弃上清;加100 μL Th1或Th2细胞专用固定剂A（FIX&PERM A），室温避光孵育15 min;加1 mL PBS、1 200 r/min离心5 min、弃上清;加100 μL Th1或Th2细胞专用固定剂B（FIX&PERM B），室温避光孵育20 min;加1 mL PBS、1 200 r/min离心5 min、弃上清;于A管中加5 μL抗人γ-IFN-PE单抗或IL-4-PE单抗，对细胞内γ-IFN或IL-4进行染色，B管中加5 μL抗鼠PE-anti-IgG1抗体，室温避光孵育20 min;加1 mL PBS、1 200 r/min离心5 min、弃上清。调整细胞浓度为105/mL做流式分析，采用cellQuest分析软件计算结果。ELISA法检测各组hs-CRP、IL-7样细胞因子（TSLP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及抗Jo-1抗体的表达水平，试剂购自美国R&D公司，严格按照说明书步骤进行，分别测量3次取平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，四组比较采用单因素方差（ANOVA）分析，组间两两比较采用独立样本t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组一般资料比较 A组男12例，女8例;年龄6～14岁，平均（9.1±2.3）岁;B组男11例，女9例;年龄5～13.3岁，平均（9.3±2.0）岁;C组男10例，女10例;年龄6.5～13.5岁，平均（9.2±2.4）岁;D组男11例，女9例，年龄6～14岁，平均（9.4±2.1）岁。四组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 四组Th1、Th2及Th1/Th2比较 四组Th1、Th2及Th1/Th2比较，差异均有统计学意义（F=8.163、15.207、5.482，P<0.001）。A、B组Th1和Th1/Th2均明显低于C、D组，且Th2均高于C、D组，差异均有统计学意义（P<0.05）。A组Th1和Th1/Th2均明显低于B组，且Th2明显高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）。C组Th1和Th1/Th2均明显高于D组，且Th2明显低于D组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 四组hs-CRP和TSLP水平比较 四组hs-CRP和TSLP水平比较，差异均有统计学意义（F=9.527、12.624，P<0.001）。A、B、C组hs-CRP和TSLP水平均高于D组，其中A组>B组>C组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 四組MCP-1和抗Jo-1抗体水平比较 四组MCP-1和抗Jo-1抗体水平比较，差异均有统计学意义（F=8.457、16.629，P<0.001）。A、B、C组MCP-1与抗Jo-1抗体均高于D组，其中A组>C组>B组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3 讨论

小儿哮喘发生的机制可能是T淋巴细胞和肥大细胞、嗜酸性粒细胞诱导的一系列免疫反应。树突状细胞（DCs）与外来抗原相互作用是过敏反应是否发生的关键步骤[6]。DCs俘获外来抗原提呈至肺淋巴结的T淋巴细胞，T淋巴细胞对抗原的反应依赖于抗原的形状以及DCs的状态。一方面，如果DCs被炎症信号预刺激后，模式识别受体改变，主动辨认抗原，产生IL-12因子并将抗原提呈给Th1细胞并分泌IL-2、INF-γ等细胞因子，最终诱导免疫耐受[7]。另一方面，如果DCs没能产生IL-12信号，则Th2细胞分化应答，分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子[8]。当再次遇到相同抗原时，作为免疫记忆的Th2细胞产生一系列的免疫反应，表现为过敏反应。因此，哮喘的发生很可能是机体Th1和Th2平衡被打破，Th1产生减少，Th2产生增多[9]。但ILD的发病机制与哮喘完全不同，研究显示，ILD发病过程中Th1细胞数量及其细胞功能占优势，Th1细胞过度分泌和释放的细胞因子可介导肺组织损伤，而持续性的肺损伤可诱导肺组织异常修复，引发肺纤维化[10]。相关动物模型证实，肺纤维化大鼠经硫化氢干预后可抑制核转录因子kappaB（NF-κB）信号通道表达，能减轻炎性细胞浸润和肺纤维化，并使Th1/Th2平衡向Th2细胞倾斜[11]。本研究结果显示，A、B组Th1和Th1/Th2均明显低于C、D组，且Th2均高于C、D组（P<0.05）;A组Th1和Th1/Th2均明显低于B组，且Th2明显高于B组（P<0.05）;C组Th1和Th1/Th2均明显高于D组，且Th2明显低于D组（P<0.05），表明哮喘持续状态与ILD均存在免疫调节紊乱，哮喘中Th2细胞占优势，而ILD中Th1细胞占优势。A组hs-CRP和TSLP水平均显著高于其他组，提示哮喘持续状态合并ILD会加重机体免疫调节紊乱和炎症反应，并向Th2细胞偏移。笔者推测，哮喘与ILD可能存在某种相互协同作用。持续性哮喘引起的气道炎症加重，会释放过量的IL-4、IL-13等炎症因子介导气道结构破坏，导致气流受阻，肺功能降低，肺部组织供氧缺少，并进一步介导肺部炎症反应，诱导CD4+淋巴细胞应答增强，并使Th0细胞向Th2细胞分化，造成Th2细胞优势。而ILD的发病中虽然Th1细胞占优势，但在哮喘发病中Th2细胞分泌的大量细胞因子可抑制Th0细胞向Th1细胞转化，并抑制Th1细胞功能。当然，两者的相互作用机制仍有待进一步证实。

ILD的病变涉及肺泡间隔、支气管、血管、末梢气腔隙周围的肺间质、肺泡腔和细支气管腔等，儿童ILD的病因、临床表现和治疗效果均与成人不同[12]。抗Jo-1抗体是抗氨基酰-tRNA合成酶抗体，被认为ILD的标志性抗体。抗Jo-l抗体可参与肺部免疫复合物的形成，触发肺巨噬细胞活性，释放趋化因子，募集其他的炎性反应成分，从而导致肺损伤[13]。MCP-1是趋化因子家族中C-C亚族中的成员，具有单核细胞趋化活性，在ILD肺组织中，MCP-1表达于上皮细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞，在单核巨噬细胞介导的炎症过程中起重要作用[14-18]。本研究结果显示，A、B、C组MCP-1与抗Jo-1抗体均高于D组，其中A组>C组>B组（P<0.05），提示哮喘持续发作会加重ILD病情，印证了以上笔者推测。临床研究证实，临床中针对哮喘持续状态合并ILD患者采用合适的激素方案，有效率50%～75%，哮喘症状缓解同时，肺部损伤程度也明显减轻，进一步说明哮喘与ILD存在密切关系[19-20]。

综上所述，儿童哮喘持续状态和ILD关系密切，Th1/Th2平衡调节可能是两者关联的重要机制，可作为两种疾病的内在机制和治疗靶点研究的参考依据。

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（收稿日期：2020-06-10） （本文编辑：田婧）