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苞叶雪莲总黄酮提取工艺优化及其粗提物抗肿瘤活性

2021-05-06许地元叶萍李海丽林鹏程

江苏农业科学 2021年4期
关键词:总黄酮正交试验

许地元 叶萍 李海丽 林鹏程

摘要:为了明确苞叶雪莲总黄酮提取工艺及其粗提物各段位抗肿瘤活性,采用正交试验优化苞叶雪莲总黄酮提取工艺,再通过组蛋白去乙酰化酶抑制试验初步评价苞叶雪莲粗提物各段位抗肿瘤活性。结果确认提取苞叶雪莲总黄酮的最佳料液比为1g∶25mL,乙醇体积分数为60%,提取温度为60℃。苞叶雪莲粗提物的正丁醇相对组蛋白去乙酰化酶具有较好的抑制作用,抑制率高达91.34%,说明苞叶雪莲粗提物的正丁醇相可作为抗肿瘤药物的筛选。

关键词:苞叶雪莲;总黄酮;正交试验;组蛋白去乙酰化酶

中图分类号:R284文献标志码:A

文章编号:1002-1302(2021)04-0130-05

作者简介:许地元(1996—),男,湖北黄冈人,硕士研究生,主要从事藏药功效及成分的研究。E-mail:xudiyuan.com@qq.com。

通信作者:李海丽,教授,主要研究方向为药理学。E-mail:1164948799@qq.com。

苞叶雪莲[Saussureaobvallata(DC.)Edgew.]为风毛菊属雪莲亚属植物,别称苞叶风毛菊,多年生草本植物,高16~60cm。其花为蓝紫色,瘦果矩圆形,长5mm,花果期7—9月,生于高山草地、流石滩、溪边石隙处、山坡多石处,生境海拔3200~4700m,是高原地區特有的一种植物,其性温、微苦,清热解毒、祛风除湿、通经活血[1]。藏医将苞叶雪莲用于风湿性关节炎、高山不适症、月经不调、胎衣不下等症[2]。在前期的预试验中发现苞叶雪莲中含有较多黄酮类化合物。黄酮类物质作为植物中广泛存在的一类化合物,在医药领域应用广泛。相关研究已经证明许多黄酮类成分对癌症、肿瘤、抗衰老、心脑血管保护、抑菌等方面有明显疗效[3-5]。关于总黄酮的提取工艺已有多篇文献报道[6-7],但目前还没有关于苞叶雪莲总黄酮提取工艺优化及抗肿瘤方面的深入研究。本试验采用正交试验优化法探讨各因素对苞叶雪莲总黄酮提取率的影响,优化苞叶雪莲总黄酮的提取工艺,同时对苞叶雪莲粗提物的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相进行了组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)活性筛选,初步研究苞叶雪莲的抗肿瘤活性。

1材料与方法

1.1仪器及试剂、材料

AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);T6新世纪紫外-可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司);XK96-3型微量振荡器(泰州市姜堰区新康医疗器械有限公司);酶标仪POLARstarOmega(德国BMGLABTECH公司);384孔白色微孔板(Greiner#784075);恒温培育箱(上海跃进医疗器械厂)。

乙醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司);硝酸铝(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);亚硝酸钠(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);氢氧化钠(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);DMSO(细胞培养级,索莱宝生物科技有限公司);H3K9me0-Eu(K)抗体(CisbioBioassays);链霉亲和素XL-665(CisbioBioassays);检测缓冲液(CisbioBioassays);HDAC1(SignalChem);组蛋白H3(1-21)赖氨酸9乙酰化生物素化肽(AnaSpec)。

藏药苞叶雪莲于2019年8月采自青海省拉脊山,由青海民族大学药学院林鹏程教授鉴别确定为藏药材苞叶雪莲[Saussureaobvallata(DC.)Edgew.]。试验时间为2019年10月至2020年6月,试验地点为青海民族大学药学院。

1.2试验方法

1.2.1苞叶雪莲的总黄酮提取方法

称取苞叶雪莲药材粉末1.00g于锥形瓶中,在一定的料液比、乙醇体积分数、提取温度条件下,固定50Hz,60℃,超声5min,回流提取时间70min,进行总黄酮的回流提取,抽滤,取出滤液,共提取2次,合并滤液并浓缩。

1.2.2总黄酮提取率的测定

1.2.2.1绘制芸香苷标准曲线

用30%乙醇(体积分数,下同)将8.75mg芸香苷对照品定容于25mL容量瓶中,摇匀,得质量浓度为0.35mg/mL的对照品溶液。用移液管吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL对照品溶液,分别置于规格为25mL的6个容量瓶中。加入30%乙醇10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5mL,摇匀。然后将1.0mL5%NaNO2加入其中,摇匀。4min后,将1.0mL10%Al(NO3)3加入其中,摇匀。10min后,将5mL1mol/LNaOH加入其中,摇匀。最后用30%乙醇定容,充分振摇。15min后,供测定使用。于500nm波长处测定吸光度,横坐标为芸香苷浓度C(mg/mL),纵坐标为相应的吸光度D,得标准曲线方程为:y=18.614x+0.0001,r2=0.9993。

1.2.2.2苞叶雪莲总黄酮提取率的测定

用10mL50%乙醇将浓缩提取液溶解,用移液管准确吸取1mL溶液,置于50mL容量瓶中,按上述方法操作,测量吸光度。

n=[SX(]C×D1000m[SX)]×100%。

式中,n表示总黄酮的提取率,C表示根据吸光度值计算出的溶液浓度(mg/mL);D表示溶液稀释倍数;m表示药材取样量(g)。

1.2.3单因素试验设计

1.2.3.1料液比对提取率的影响

准确称取药材粉末1.00g,置于50mL圆底烧瓶中,乙醇体积分数60%,料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL),50Hz,60℃,超声5min,然后在提取温度60℃条件下,水浴回流提取70min,考察,计算提取率,每组试验平行操作3次,取平均值。

1.2.3.2乙醇体积分数对提取率的影响

准确称取药材粉末1.00g,置于50mL圆底烧瓶中,分别加入料液比1g∶25mL,乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的提取溶剂,50Hz,60℃,超声5min,然后在提取温度60℃条件下,水浴回流提取70min,计算提取率,每组试验平行操作3次,取平均值。

1.2.3.3提取温度对提取率的影响

准确称取药材粉末1.00g,置于50mL圆底烧瓶中,料液比1g∶25mL,乙醇体积分数60%,50Hz,60℃,超声5min,分别于40、50、60、70、80℃的提取温度下水浴回流70min,计算提取率,每组试验平行操作3次,取平均值。

1.2.4正交试验设计

本试验将影响苞叶雪莲总黄酮提取率的料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取温度(D)作为试验因素,用正交试验软件设计试验,选取L9(34),空出第3列为C因素作空白误差分析,以提取率作为参考指标。具体因素及水平见表1。

1.2.5组蛋白去乙酰化酶抑制试验的样品及溶液配制

组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)是一种依赖锌离子的金属蛋白酶,它与多种原癌基因和肿瘤抑制基因密切相关。HDACs过度表达并被转录因子募集,会导致特定基因被不正常抑制,从而导致肿瘤或其他疾病的发生[8-9]。HDACs抑制剂通过与锌离子螯合竞争性地抑制HDACs的催化活性,诱导肿瘤细胞分化和凋亡,从而抑制肿瘤细胞的生长[10]。HDAC1是HDACs的一种,位于细胞核内,调控组蛋白乙酰化修饰[11-12]。

1.2.5.1苞叶雪莲提取物的萃取

将苞叶雪莲药材粉碎(3.5kg),浸泡在一定体积的95%乙醇中24h,用纱布过滤,取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步骤重复3次,将3次所得的浸膏合并,得到浸膏①。继续将95%乙醇浸泡过的滤渣放入65%乙醇浸泡24h,用纱布过滤,取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步骤重复3次,将3次所得的浸膏合并,得到浸膏②。继续将65%乙醇浸泡过的滤渣放入去离子水中浸泡24h,用纱布过滤,取上清液旋蒸成浸膏后;按照上述步骤重复3次,将3次所得的浸膏合并,得到浸膏③。将所得浸膏①②③合并得到苞叶雪莲粗提物,用适量的水溶解。置于2000mL的分液漏斗中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,浓缩,分别得到石油醚相A、乙酸乙酯相B、正丁醇相C、水相D。

1.2.5.2酶反应体系缓冲液的配制

缓冲液的配方为50mmol/LTris-HCl,pH值为8.4,0.137mmol/LNaCl,2.7mmol/LKCl,1mmol/LMgCl2,0.01%吐温20。

1.2.5.3化合物溶液的配制

分别取石油醚相A、乙酸乙酯相B、正丁醇相C、水相D的干浸膏各0.4mg,分别溶解于100μL的DMSO中,超声5min。再分别取1μL溶解样品的DMSO,分别加入上述配制的缓冲溶液99μL,得到用于检测苞叶雪莲抗HDAC1酶有效提取物A、B、C、D浓度为40μg/mL的溶液。

1.2.5.4酶溶液的配制

将50μgHDAC1加入上述配制好的缓冲液稀释为浓度为10ng/μL的酶溶液,备用。

1.2.5.5底物溶液的配制

组蛋白H3(1-21)赖氨酸9乙酰化生物素化肽[H3(1-21)K9]的初始浓度为5mmol/L,加入上述配制好的缓冲液稀释至浓度为0.5μmol/L,备用。

1.2.5.6抗体储备液的配制

取H3K9me0-Eu(K)抗体40μL用检测缓冲液稀释50倍,备用。

1.2.5.7链霉素和素XL-665(SA-XL665)储备液的配制

取浓度为16.67μmol/L的链霉素和素XL-66512μL,用检测缓冲液稀释166.7倍,备用。

1.2.6HDAC1酶存活率的测定方法

取“1.2.3.3”节制备的溶液A、B、C、D各4μL置于396孔板中,每组设3个复孔,再分别加入2μLHDAC1酶,室温条件下反应5min,加入4μLH3(1-21)K9底物溶液,37℃,培养箱中培养60min。加入5μLSA-XL665储备液和5μLH3K9me0-Eu(K)抗体储备液,665nm测值,得试验组吸光度。

将4μL的缓冲溶液置于396孔板中,再分别加入2μLHDAC酶,室温条件下反应5min,加入4μLH3(1-21)K9底物溶液,37℃,培养箱中培养60min。加入5μLSA-XL665储备液和5μLH3K9me0-Eu(K)抗体储备液,665nm测值,得对照组吸光度。计算HDAC1酶存活率:

存活率=试验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.2.7数据统计分析

采用MicrosoftExcel2010、Origin2018、SPSS20.0、GraphPad6.0进行试验数据处理、分析及绘图。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1不同料液比对苞叶雪莲中总黄酮提取率的影响

由圖1可以看出,料液比在1g∶20mL之后,提取率变化不明显。其主要原因可能是当料液比大于1g∶20mL之后,总黄酮大部分已经溶出,增大溶剂对体系作用不明显,为节约提取成本,正交试验中料液比因素水平为1g∶15mL、1g∶20mL、1g∶25mL。

2.1.2不同乙醇体积分数对苞叶雪莲中总黄酮提取率的影响

由图2看出,提取剂浓度低于60%时,总黄酮的含量随着乙醇体积分数的升高而增大,之后,提取率下降,这可能是因为苞叶雪莲总黄酮的极性与60%乙醇最为相似,故浓度过低或过高都会降低总黄酮的溶出,与此同时增加了叶绿素等其他色素物质的溶出,干扰试验。因此正交试验中选择乙醇体积分数因素水平为40%、50%、60%。

2.1.3不同提取温度对苞叶雪莲中总黄酮提取率的影响

由图3看出,提取温度超过60℃,提取率随着温度的提升反而降低,可能是因为苞叶雪莲中的黄酮类物质遇热不稳定,结构分解,导致测量的总黄酮含量降低。而在40~50℃时,总黄酮提取率有明显的提升,可能是温度升高后,增加了物质的溶出速度。因此正交试验选择提取温度因素的水平为50、60、70℃。

2.2正交试验结果与分析

由上述单因素试验结果可知3个因素对苞叶雪莲总黄酮提取率的影响,每个因素选取3个水平,其中温度为50、60、70℃,料液比为1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL),乙醇体积分数为40%、50%、60%。按照L9(34)进行正交试验,空出第3列为C因素作空白误差分析,因素水平见表1,正交试验安排及结果见表2,方差分析结果见表3。

由表2、表3可知RB>RA>RD,乙醇体积分数间存在明显差异,最佳提取工艺为A3B3D2,即最佳提取工艺为料液比1g∶25mL,乙醇体积分数为60%,提取温度为60℃。同时方差分析可以得出乙醇体积分数对提取结果具有显著性影响,与极差分析结果一致。取A3B3D2条件试验3次,结果取平均值,得到总黄酮的提取率为1.589%,说明该工艺所选的参数可行。

2.3苞叶雪莲提取物抗HDAC1酶活性

由图4可以看出,与对照组相比,石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相均具有显著性差异(其中石油醚相P<0.05,乙酸乙酯相、正丁醇相、水相P<0.001)。以抑制HDAC1酶的能力为活性指标评价苞叶雪莲的抗肿瘤活性,一般认为当HDAC1酶存活率低于50%时,具有明显的抗肿瘤活性。由图4结果可知,乙酸乙酯相、正丁醇相及水相均具有较好的抗肿瘤作用,其中正丁醇相抗肿瘤作用最佳,抑制率高达91.34%。

3讨论与结论

3.1正交试验设计的苞叶雪莲总黄酮最佳提取工艺

在提取时间为70min的情况下,料液比1g∶25mL、乙醇体积分数60%、提取温度60℃为苞叶雪莲总黄酮的最佳提取工艺,得到总黄酮的提取率为1.589%。同时,各因素对总黄酮提取率的影响顺序为乙醇体积分数>料液比>提取温度。

3.2研究意义

癌症是世界上最致命的疾病之一[13]。除了遗传因素,癌症的发生还涉及表观遗传修饰,包括DNA(甲基化和去甲基化)和组蛋白的共价修饰[14-15]。表观遗传调控通过相应的酶实现可逆的修饰过程。组蛋白赖氨酸乙酰化水平受组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和组蛋白乙酰转移酶(HATS)的调控,在表观遗传修饰中起着关键作用[16-19]。HDACs在不同的肿瘤中都有过表达[20],组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACis)已被证明通过多种机制显著抑制细胞增殖、血管生成和转移[21]。到目前为止,在人类中已经发现了18种HDAC亚型,它们可以分为4类。Ⅰ类(1、2、3、8)、Ⅱ类(4、5、6、7、9、10)和Ⅳ(11)HDAC是依赖于Zn2+的酶,而Ⅲ类HDAC(SIRT1-7)的活性需要NAD+[22-24]。市場上已经批准了5种HDACis,即伏立宁(SAHA)、贝力宁(PXD101)、潘诺比妥(LBH589)、罗米地平(FK228)和氯氮酰胺(CS055)。然而,大多数HDACis对实体瘤的抗肿瘤效果并不理想,因此开发新型HDACis对实体肿瘤的高效抗肿瘤具有重要意义。

本试验优化了苞叶雪莲总黄酮提取工艺,确定了其最佳提取工艺,且利用组蛋白去乙酰化酶抑制试验明确了苞叶雪莲粗提物中萃取的乙酸乙酯相、正丁醇相、水相均具有良好的抑制HDAC1酶的活性,其中正丁醇相抑制效果最好。后续可通过研究苞叶雪莲的正丁醇相提取部位,开发出一种HDACs抑制剂,为抗肿瘤药物的开发提供思路。

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